石家莊市中醫(yī)院脾胃科

孟 萍 南月敏△ 趙素賢△(石家莊 050051)

提要 目的：研究益氣活血方在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中抑制肝細胞凋亡、阻止肝纖維化進展的作用及機制。方法：將27只Wistar大鼠隨機分為3組，模型組和益氣活血方治療組腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，對照組腹腔注射等量橄欖油。益氣活血方治療組以益氣活血方中藥配方顆粒劑溶液灌胃，另2組大鼠以0.9%氯化鈉溶液灌胃。HE、Masson染色觀察大鼠肝纖維化程度；肝組織凋亡相關基因FasL、Fas、Bax、Bcl-2、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3) mRNA表達以qRT-PCR檢測，蛋白表達以Western Blot檢測。結果：模型組大鼠肝小葉結構紊亂，纖維組織增生形成纖維間隔，并可見假小葉，伴隨FasL、Fas、caspase-3mRNA及Bax mRNA及蛋白表達上調，Bcl-2mRNA及蛋白表達下調，與對照組比較差異有非常顯著性(P均<0.01)。應用益氣活血方肝纖維化明顯減輕，F(xiàn)asL、Fas、caspase-3mRNA和Bax mRNA及蛋白表達明顯抑制，Bcl-2mRNA及蛋白表達明顯上調(P均<0.05)。結論：益氣活血方可通過抑制肝細胞凋亡發(fā)揮抗炎抗肝纖維化作用。

肝纖維化指肝臟細胞外基質過量堆積致肝組織正常結構功能發(fā)生異常改變的嚴重病理過程。肝細胞凋亡是多種肝臟疾病的共同病理表現(xiàn)，新近研究發(fā)現(xiàn)，[1]伴隨肝損傷而產生的凋亡可能對肝臟炎癥及纖維化產生一定影響，與肝纖維化的持續(xù)進展相關。中藥有效成分有多途徑、多靶點及安全性高的特點，在肝纖維化治療中具有明顯的優(yōu)勢。研究證實，益氣活血方可調節(jié)肝細胞自噬，減輕肝損傷，抑制肝星狀細胞(HSC)活化，促進轉化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型膠原等降解，進而阻止或逆轉肝纖維化。[2-3]然而，其對肝細胞凋亡的影響尚不十分清楚。本研究中，我們利用CCl4誘導大鼠肝纖維化模型，探討益氣活血方是否通過調節(jié)死亡受體途徑Fas/FasL及線粒體途徑Bcl-2/Bax的表達發(fā)揮抗肝纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 選用27只雄性Wistar大鼠，體質量180～220 g，購買于河北醫(yī)科大學實驗動物中心。兔抗GAPDH抗體購自美國Affinity公司；兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗體購自英國Abcam公司；山羊抗兔二抗購自美國ProteinTech公司。益氣活血自擬方以黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金等中藥配伍組成，由江陰天江藥業(yè)有限公司免煎顆粒劑制備沖劑。

1.2 動物模型建立及標本采集 實驗大鼠隨機分為對照組、模型組和益氣活血方治療組，每組9只。模型組和益氣活血方治療組大鼠腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液(0.2 mL/100 g體質量)，對照組大鼠以相同方法給予等量的橄欖油，2次/周。建模的同時，益氣活血方治療組大鼠以自擬益氣活血方中藥配方顆粒劑溶液灌胃(1 mL/100 g體質量)，其他2組大鼠灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d。于第8周末處死實驗大鼠，取出肝臟，適量肝組織以4%中性甲醛溶液固定，余肝組織經液氮快速冷凍，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝臟組織病理學檢查 固定后的肝組織經透明、包埋、切片，行HE染色及Masson三重染色。于光鏡下觀察肝纖維化程度。每個標本隨機選取5個視野，參照CCl4肝纖維化新型分期標準[4]，對肝纖維化進行評估。

1.4 肝組織FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達 采用qRT-PCR法，各基因引物序列見表1。Trizol試劑提取肝組織總RNA，應用PrimeScriptTMRT reagent Kit(日本Takara公司)逆轉錄合成cDNA，以GAPDH作為內參照，應用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行cDNA擴增，反應體系為20 μL。結果運用2-△△CT法進行分析。詳見表1。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.5 肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達 取肝組織20 mg，加蛋白裂解液1 mL，4℃研磨成勻漿，經離心分離制備蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒定量，每組取總蛋白20 μg上樣，12%SDS-PAGE分離蛋白質，濕轉恒流37 mA 40 min，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入GAPDH(1∶10 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜。充分洗滌，分別加入辣根過氧化物酶標記兔抗大鼠第二抗體(1∶20 000)，室溫孵育1 h，充分洗滌后，發(fā)光、顯影、定影、曝光、掃描，以GAPDH為內參照。用掃描儀將硝酸纖維素膜上的蛋白條帶掃描至計算機，應用Quantity One軟件分析條帶灰度。目的蛋白灰度值與內參照蛋白灰度值的比值即為目的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理應用SPSS16.0軟件。多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 益氣活血方可減輕CCl4誘發(fā)的大鼠肝纖維化 如圖1所示，對照組大鼠肝小葉結構完整，未見纖維結締組織增生(S0)。模型組大鼠肝小葉結構紊亂，纖維組織增生形成纖維間隔，可見假小葉(S5.49±0.23)。應用益氣活血方大鼠肝纖維化顯著改善，肝小葉結構基本存在(S3.64±0.41)，與模型組相比，差異有非常顯著性(P<0.001)，見圖2。

注： A HE染色結果(×200)；B Masson染色結果(×200)。

圖2 肝纖維化模型組與益氣活血方治療組肝纖維化分期比較

2.2 實驗大鼠肝組織FasL、Fas mRNA表達 如圖3A所示，qRT-PCR檢測結果，肝纖維化模型組FasL、Fas mRNA表達與對照組相比均顯著增高(P值均<0.01)，應用益氣活血方組大鼠肝組織FasL、Fas mRNA表達水平較模型組明顯降低(P值均<0.05)。

2.3 實驗大鼠肝組織Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表達 如圖3(B、C、D)所示，qRT-PCR及Western blot檢測結果，肝纖維化模型組大鼠肝組織Bax mRNA和蛋白表達與對照組相比均明顯增加，而Bcl-2mRNA和蛋白表達明顯減少(P值均<0.01)；使用益氣活血方干預，Bax mRNA和蛋白表達較模型組明顯下調，而Bcl-2mRNA及蛋白表達較模型組明顯上調(P值均<0.05)。

2.4 實驗大鼠肝組織caspase-3mRNA及蛋白表達 如圖3(B、C、D)所示，肝纖維化模型組caspase-3mRNA表達明顯高于對照組(P<0.001)，應用益氣活血方組較模型組明顯降低(P<0.01)。Western blot結果顯示，caspase-3蛋白表達各組間無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

肝纖維化是肌體對慢性肝損傷的一種修復愈合反應，是各種肝損傷的共有病理過程。注射CCl4為建立肝纖維化模型經典方法，廣泛應用于防治肝纖維化藥物篩選及其作用機制的研究。本研究通過復制經典的CCl4動物模型[5]，注射8周后觀察發(fā)現(xiàn)，隨著CCl4應用，大鼠肝組織纖維結締組織增生明顯，纖維化分期達(S5.49±0.23)，說明肝纖維化大鼠模型制備成功。

肝纖維化多屬中醫(yī)“積聚”“臌脹”等范疇。中藥組方在臨床上應用于肝臟疾病的預防及治療，可起到調節(jié)免疫，保護肝臟，逆轉肝纖維化等作用。益氣活血方由黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金組方而成。方中黃芪為君藥，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水退腫功效，可促進HSC凋亡，降低膠原沉積，推動膠原降解，降低TGF-β1的含量，且抗炎、免疫調節(jié)及抗氧化，有效抗肝纖維化。[6]丹參活血祛瘀、涼血安神，可抑制靜止HSC活化，并增強自然殺傷細胞的活化以清除活化的HSC，下調肝組織TGF-β表達。[7-8]云茯苓利水滲濕、健脾，可對抗自由基、抑制肌體的脂質過氧化。[9]白豆蔻可化濕行氣、溫中止嘔，調節(jié)TGF-β表達，抑制細胞外基質的合成，緩解肝纖維化程度。[10]郁金具有活血止痛、行氣解郁、利膽退黃的功效，可改善肝功能，減輕肝組織炎癥反應及氧化應激反應，調節(jié)肝細胞免疫，并能阻止肝細胞凋亡。[11-12]本研究在應用CCl4造模的同時予益氣活血方灌胃進行干預，結果顯示肝組織纖維組織增生減少，纖維化分期降至(S3.64±0.41)，提示益氣活血方可減少膠原組織沉積，阻止并逆轉肝纖維化。

注：A FasL、Fas mRNA水平變化；B Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA水平變化；C、D Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白表達變化。

研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞凋亡在肝纖維化的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，凋亡肝細胞誘導巨噬細胞、HSC及Kupffe細胞吞噬凋亡小體，致使促纖維化因子分泌增多并激活HSC，引起肝纖維化。[13]為了進一步明確益氣活血方緩解肝纖維化的分子機制，本研究觀察了不同組別大鼠肝組織凋亡通路因子的表達變化。研究結果顯示，經CCl4注射8周的肝纖維化模型組FasL、Fas表達明顯上調，應用益氣活血方干預，可明顯抑制FasL、Fas的表達，表明肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展與FasL、Fas的表達及其誘導的肝細胞凋亡有關。Fas是細胞膜表面受體蛋白，其細胞內區(qū)傳導“死亡信號”的結構域與FasL結合而活化，誘導下游內在及外在細胞凋亡信號轉導通路，誘發(fā)肝細胞凋亡而致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

線粒體介導的凋亡途徑主要受Bcl-2家族調控，Bcl-2和Bax分別為家族中抗凋亡和促凋亡的調控基因。肝細胞發(fā)生凋亡時，Bax可破壞線粒體膜的完整性，使線粒體膜電位降低，細胞色素C釋放增加，進而與凋亡蛋白酶活化因子-1結合激活caspase-9前體，然后激活caspase-3等，從而誘導細胞凋亡；[14-15]而Bcl-2則在線粒體外膜發(fā)揮作用，以維持膜的完整性。[16]Mitchell[17]等應用Bcl-2轉基因小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)肝細胞Bcl-2過度表達在肝損傷早期可對抗肝損傷，其機制可能與減輕線粒體功能障礙及脂質過氧化有關。本研究結果提示，Bax在肝纖維化模型組可顯著上調，而Bcl-2明顯下降，經益氣活血方干預后，Bax的表達明顯降低，Bcl-2有所升高，說明益氣活血方可阻止肝細胞凋亡，減輕肝損傷。

caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶，正常情況下，caspase-3以無活性的酶原形式存在于細胞內。當作為傳感器的細胞表面死亡受體Fas接受由死亡配體FasL發(fā)出的死亡信號，使Fas激活，并傳遞到細胞內，激活caspase家族成員，借助凋亡信號結構域(死亡效應域、caspase“募集”結構域)導致caspase成員相繼激活，最終使caspase-3激活，進而降解特定的靶蛋白，導致細胞死亡。[18]caspase-3是死亡受體通路、線粒體通路及其內質網應激通路的匯聚點，是凋亡過程的中心環(huán)節(jié)和關鍵執(zhí)行者。[19]本研究發(fā)現(xiàn)，模型組caspase-3mRNA的表達較對照組明顯上調，益氣活血方干預后caspase-3表達減少，表明由于Fas的激活，進一步通過信號轉導激活caspase-3，與疾病的進展密切相關，隨著纖維化的形成而表達增強，促使細胞凋亡。研究證實，在大鼠模型中應用caspase阻滯劑可抑制肝細胞凋亡，明顯減輕肝纖維化。[20]

筆者研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血方可抑制CCl4導致的肝細胞凋亡，阻止肝纖維化進展，其可能的機制為：CCl4誘導可產生大量的自由基，在細胞膜上發(fā)生脂質過氧化反應，生成氧自由基增多，激活FasL/Fas系統(tǒng)，進一步激活caspase家族中的caspase-3，形成蛋白酶促級聯(lián)反應，激活核酸內切酶，致DNA斷裂、染色體濃縮，最終導致細胞凋亡。而益氣活血方可對抗自由基，降低肝組織氧化應激反應，抑制FasL/Fas系統(tǒng)的激活，上調線粒體途徑Bcl-2/Bax比例，繼而抑制caspase-3的激活，從而抑制細胞凋亡。

綜上所述，益氣活血方對CCl4所致的大鼠肝損傷起到保護作用，其機制可能通過抑制肝細胞凋亡，有效阻止或延緩肝纖維化的形成。益氣活血方抗纖維化機制的研究結果為其在臨床的應用提供了理論依據(jù)。