張德全，敖俊紅，祝 賀，夏志寬，廖 勇，楊蓉婭

毛孢子菌可引起多種疾病，對(duì)免疫功能正常人群而言，可出現(xiàn)白毛結(jié)節(jié)病和超敏性肺炎，而在惡性血液病患者中常引起真菌血癥、心內(nèi)膜炎、腹膜炎和腦膜炎[1-5]。侵襲性毛孢子菌病常見(jiàn)于惡性血液病、燒傷、艾滋?。ˋIDS）、接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療的患者，以及接受心臟瓣膜或眼科手術(shù)者，還可發(fā)生于新生兒或衰弱性疾病患者中[1,2,6,7]。毛孢子菌感染缺乏特征性臨床表現(xiàn)，僅依靠臨床癥狀很難進(jìn)行診斷。同時(shí)，毛孢子菌對(duì)棘白菌素類藥物天然耐藥，而臨床中棘白菌素類藥物常作為對(duì)具有患侵襲性真菌病風(fēng)險(xiǎn)患者的預(yù)防性用藥，因此應(yīng)更加警惕毛孢子菌感染的漏診問(wèn)題。

播散性毛孢子菌病的病死率高達(dá)50%～80%，在惡性血液病并出現(xiàn)持續(xù)性中性粒細(xì)胞減少患者中，病死率甚至可達(dá)100%[2,8,9]。阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T. asahii）是毛孢子菌感染最常見(jiàn)的致病菌[10]，在臨床診斷中對(duì)毛孢子菌感染的診斷及對(duì)T. asahii的快速識(shí)別顯得尤為重要。傳統(tǒng)的基于形態(tài)學(xué)特征和生化特性的檢測(cè)方法，一方面需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)要求較高，檢測(cè)人員需要專業(yè)化培訓(xùn)；另一方面則容易出現(xiàn)屬間混淆，且常無(wú)法鑒定至種水平[11-13]。因此，近年來(lái)為克服傳統(tǒng)鑒定方法的不足，很多學(xué)者將不同核酸擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid amplification technology，NAAT）應(yīng)用于毛孢子菌的檢測(cè)和鑒定中。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是應(yīng)用最為廣泛的擴(kuò)增技術(shù)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，NAAT 的種類也逐步增多。目前已應(yīng)用到毛孢子菌檢測(cè)和鑒定的NAAT有：普通PCR、巢氏及半巢氏PCR（nested PCR）、多重PCR（multiplex PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR、RCA、LAMP 以及上述技術(shù)與其他生化檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用等。本文將針對(duì)已應(yīng)用于毛孢子菌研究中的變溫NAAT 和恒溫NAAT 兩大類，從應(yīng)用價(jià)值和目前存在問(wèn)題的兩個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 毛孢子菌鑒定的核糖體基因區(qū)選擇

核糖體基因在細(xì)胞中以多拷貝形式存在，同時(shí)具有高突變性，在自然條件下可以出現(xiàn)多種變異，同時(shí)在高突變區(qū)間又存在相對(duì)保守區(qū)域，即異種同源性?？梢葬槍?duì)這些突變區(qū)和保守區(qū)設(shè)計(jì)不同擴(kuò)增目的的引物進(jìn)行靶基因擴(kuò)增，以達(dá)到對(duì)病原菌屬間、種間甚至株間進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的目的。較常應(yīng)用于真菌分類鑒定的核糖體基因有基因內(nèi)間隔區(qū)（intergenic spacer，IGS）、內(nèi)轉(zhuǎn)錄 間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、18S rDNA 和26S rDNA 的D1、D2 區(qū)。其中ITS 區(qū)因?qū)賰?nèi)種間差異較大而種內(nèi)差異微小，已成為真菌分類鑒定最常用的選擇。

然而對(duì)于T. asahii、T. japonicum、T. asteroides、T. mucoides和T. dermatis而言，ITS 和D1/D2 區(qū)的基因序列高度相似，基因序列中僅表現(xiàn)為極少的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），序列長(zhǎng)度并沒(méi)有差異[14,15]。徐英春團(tuán)隊(duì)報(bào)道基于ITS區(qū)對(duì)毛孢子菌進(jìn)行鑒定時(shí)，T. mucoides和T. dermatis不能被區(qū)分開(kāi)[16]。Sugita 等[17]在2002 年也發(fā)現(xiàn)ITS區(qū) 不 能 將T. asahii、T. asteroides、T. japonicum、T.coremiiforme和T. faecale等近源菌種進(jìn)行區(qū)分。因此，ITS 區(qū)不適用于進(jìn)行毛孢子菌屬的種間鑒定。相反，IGS1 區(qū)由于具有更高的序列差異，更適用于對(duì)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系較近的毛孢子菌菌種進(jìn)行區(qū)分[14,15,17,18]。

Sugita 等[17]根據(jù)IGS1 區(qū)的序列多態(tài)性描述了T. asahii的基因型，將來(lái)自于日本、美國(guó)和巴西的43 株T. asahii分為5 個(gè)基因型。至今，通過(guò)IGS1區(qū)序列多態(tài)性分析共發(fā)現(xiàn)了T. asahii的15 個(gè)基因型。Sellami 等[19]應(yīng)用常規(guī)PCR 技術(shù)基于通用引物擴(kuò)增IGS1 區(qū)對(duì)來(lái)自于突尼斯的30 株毛孢子菌進(jìn)行了鑒定，并首次報(bào)道了該地區(qū)T. asahii的基因分型。Taverna 等[20]分別擴(kuò)增了41 株毛孢子菌的D1/D2區(qū)、ITS 區(qū)和IGS1 區(qū)，并與Genebank 中的標(biāo)準(zhǔn)株序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)IGS1 區(qū)序列分析，將其中的38 株菌分別鑒定為T(mén). asahii（n=29）、T. inkin（n=3）、T. montevideense（n=3）、T. faecale（n=2） 和T.dermatis（n=1），但這38 株菌的全部D1/D2 區(qū)和部分ITS 區(qū)序列分析比對(duì)結(jié)果由于種間的相似度差異極其接近，無(wú)法進(jìn)行種水平的區(qū)分。在一項(xiàng)印度的研究中，將31 株臨床來(lái)源的毛孢子菌的ITS 和IGS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析后，發(fā)現(xiàn)有30 株可以通過(guò)IGS1 區(qū)被準(zhǔn)確鑒定到種水平[21]。鑒于上述文獻(xiàn)報(bào)道，在今后應(yīng)用NAAT 對(duì)毛孢子菌進(jìn)行鑒定的研究中，應(yīng)選擇IGS1 區(qū)作為靶基因，以提高種水平鑒定的準(zhǔn)確度。

2 變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2.1 常規(guī)PCR

PCR 技術(shù)由Mullis 在1985 年發(fā)明，是一種對(duì)特異DNA 片段進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)，可以使少量的DNA 或RNA 進(jìn)行大量復(fù)制，是遺傳與分子生物學(xué)分析的基石，目前已在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Sugita 等[22]早在1998 年將毛孢子菌屬特異性引物應(yīng)用于常規(guī)PCR 擴(kuò)增毛孢子菌，共對(duì)20 個(gè)菌種進(jìn)行了擴(kuò)增，最早實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用NAAT 對(duì)毛孢子菌屬水平的初步鑒定。近期Premamalini 等[23]通過(guò)Sugita 報(bào)道的毛孢子菌屬特異性引物對(duì)臨床來(lái)源的72 株毛孢子菌菌株進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，在確定所有菌株均為毛孢子菌后，再進(jìn)一步通過(guò)生理生化特性和表型特征進(jìn)行種水平的鑒定。由于上述兩項(xiàng)研究中的毛孢子菌屬特異性引物基于18S rDNA 進(jìn)行設(shè)計(jì)，因此無(wú)法進(jìn)一步基于IGS1 區(qū)進(jìn)行毛孢子菌的基因分型和菌種鑒定研究。

早在1998 年，Sugita 等[24]就報(bào)道了應(yīng)用PCR對(duì)T. asahii進(jìn)行鑒定的研究，該研究基于ITS 區(qū)設(shè)計(jì)T. asahii種特異性引物，78 株毛孢子菌中的14 株T. asahii全部呈陽(yáng)性結(jié)果。但實(shí)際上該文獻(xiàn)作為陽(yáng)性結(jié)果報(bào)道的T. asahii var. coremiformisCBS2482 和T.asahii var. faecalisCBS4828 目前已被分別確定為T(mén).coremiformis和T. faecalis，這可能是由于在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)即按照舊的菌種分類作序列比對(duì)，因此不建議將該報(bào)道中的引物應(yīng)用于今后的菌種鑒定研究中。以往應(yīng)用于臨床感染樣本中毛孢子菌檢測(cè)的常規(guī)PCR技術(shù)多依賴于擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序。Kotwal 等[25]提取了來(lái)源于同一個(gè)家庭中3 名女性的病甲組織陽(yáng)性培養(yǎng)物的DNA，應(yīng)用ITS1 和ITS4 作為引物對(duì)所提取DNA樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最后通過(guò)ITS 區(qū)產(chǎn)物的測(cè)序明確感染菌種為T(mén). asahii、T. asteroides和T. faecale，但筆者推測(cè)，該研究中的3 個(gè)毛孢子菌種可能是1 個(gè)菌種，需要應(yīng)用IGS1 區(qū)進(jìn)行重新比對(duì)方可最終確定菌種。Hazirolan 等[26]對(duì)從住院患者尿液分離出的68株T. asahii進(jìn)行了IGS1 區(qū)PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該68 株菌分別屬于基因型1、3、4、5、6、9。Sellami 等[19]同樣通過(guò)應(yīng)用PCR 擴(kuò)增IGS1 區(qū)，對(duì)來(lái)自于突尼斯的30 株毛孢子菌進(jìn)行了鑒定，并首次報(bào)道了該地區(qū)T.asahii的基因分型。

2.2 巢氏PCR

巢氏PCR 是在首輪PCR 過(guò)程中應(yīng)用1 對(duì)外引物進(jìn)行擴(kuò)增，而后以首輪的產(chǎn)物作為模板再應(yīng)用內(nèi)引物進(jìn)行第2 輪擴(kuò)增，可明顯提高PCR 檢測(cè)的敏感性，適用于對(duì)微量靶序列的擴(kuò)增，如各類臨床組織樣本中的病原體檢測(cè)。Alonso 等[27]對(duì)10 例多發(fā)性硬化患者的腦組織切片和冰凍組織利用巢氏PCR 擴(kuò)增ITS 區(qū)，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在8 例患者的臨床樣本中檢測(cè)到T. mucoides。Zhang 等[28]通過(guò)巢氏PCR 檢測(cè)380 名日本健康人皮膚中T. asahii的定植情況，先應(yīng)用IGS 區(qū)通用引物26SF 和5SR 進(jìn)行首輪擴(kuò)增，而后應(yīng)用種特異性引物進(jìn)行第2 輪擴(kuò)增，結(jié)果提示T. asahii的高定植率，最終得出T. asahii是人類皮膚正常微生物群落組成部分的結(jié)論。Sano 等[29]通過(guò)對(duì)30 份尸檢組織標(biāo)本進(jìn)行3 組不同的巢氏PCR 擴(kuò)增，分別驗(yàn)證了基于18S、26S 和ITS 區(qū)擴(kuò)增的檢測(cè)性能，結(jié)果提示基于ITS 區(qū)的擴(kuò)增全部為陰性結(jié)果，而基于26S 區(qū)擴(kuò)增的檢出率高于基于18S 區(qū)。然而，Sano 等的研究中所應(yīng)用的基于ITS 區(qū)的巢氏PCR 擴(kuò)增，是以Sugita 在2001 年報(bào)道的巢氏PCR 技術(shù)對(duì)深部毛孢子菌感染患者血清進(jìn)行檢測(cè)的研究為參考，所應(yīng)用引物和擴(kuò)增條件均相同，但Sano 等所獲得結(jié)果與Sugita 等[30]報(bào)道檢測(cè)陽(yáng)性率為（9/11）的結(jié)果截然不同。兩項(xiàng)研究惟一不同之處在于前者是對(duì)經(jīng)甲醛固定并行石蠟包埋的組織進(jìn)行檢測(cè)，而后者是針對(duì)感染患者血清進(jìn)行檢測(cè)。趙遜等[31]應(yīng)用Sugita 報(bào)道的巢氏PCR 引物對(duì)來(lái)源于播散性毛孢子菌病患者的皮膚活檢組織和肝臟穿刺標(biāo)本蠟塊組織，以及33個(gè)BALB/c 小鼠播散性毛孢子菌感染模型的肝臟石蠟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，首次PCR 陽(yáng)性率為69.7%，第2 次PCR 陽(yáng)性率為96.9%。

巢氏PCR 可以不受平臺(tái)期對(duì)擴(kuò)增效率的限制，其對(duì)模板的放大倍數(shù)亦高于單次擴(kuò)增，因此檢測(cè)敏感性得到大幅度提高。而且由于第2 輪的引物與第1輪不同，降低了非特異性擴(kuò)增的幾率，在一定程度上提高了反應(yīng)的特異性。此外，第二階段的反應(yīng)常常是第一階段反應(yīng)的驗(yàn)證過(guò)程，如果第一階段反應(yīng)的產(chǎn)物不是目的擴(kuò)增產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)便不再進(jìn)行擴(kuò)增，保證了整個(gè)反應(yīng)的正確性和精準(zhǔn)度。

2.3 多重PCR

多重PCR 技術(shù)應(yīng)用2 對(duì)以上引物，對(duì)多個(gè)靶基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到多重檢測(cè)的目的。早在2001 年，F(xiàn)ujita 等[32]就試圖通過(guò)多重PCR 技術(shù)對(duì)毛孢子菌進(jìn)行鑒定，他們應(yīng)用2 對(duì)通用引物ITS1、ITS4 和ITS3、ITS4，對(duì)T. asahii、T. asteroides和T.cutaneum進(jìn)行擴(kuò)增，并試圖利用不同菌種間兩種產(chǎn)物的長(zhǎng)度差異，在瓊脂糖凝膠電泳中對(duì)不同菌種進(jìn)行區(qū)分，但研究結(jié)果顯示T. asahii和T. asteroides的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度極其相近，無(wú)法對(duì)上述兩個(gè)菌種進(jìn)行區(qū)分。隨后Spiess 等[33]在2007 年應(yīng)用多重PCR 技術(shù)對(duì)14 種致病真菌同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)DNA 微陣列中的特異性核酸探針對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，其微陣列芯片中含有T. asahii特異性探針，在對(duì)來(lái)源于46 例中性粒細(xì)胞減少癥患者的91 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)后，成功從其中1 例患者的血液樣本和肺泡灌洗液樣本中檢測(cè)到T.asahii。最近，Arastehfar 等[34]通過(guò)多重PCR 技術(shù)，應(yīng)用基于18S rDNA 設(shè)計(jì)的種特異性引物分別對(duì)來(lái)源于CBS 的10 株T.asahii和7 株T.lactis進(jìn)行了檢測(cè)，并通過(guò)臨床來(lái)源菌株進(jìn)行了確證實(shí)驗(yàn)。該研究真正在擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了毛孢子菌的快速檢測(cè)和鑒定，無(wú)需在擴(kuò)增完成后進(jìn)行任何后續(xù)操作，但由于以18S rDNA 設(shè)計(jì)種特異性引物，其鑒定的準(zhǔn)確性尚需更大樣本量更多菌種的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR

通過(guò)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算Ct 值，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可對(duì)起始模板量進(jìn)行定性和絕對(duì)、相對(duì)定量分析。Makino 等[35]在研究日常食品酵母污染時(shí)，應(yīng)用SYBR green I 作為熒光染料進(jìn)行實(shí)行熒光PCR，根據(jù)26S 的D1 和D2 區(qū)設(shè)計(jì)T. asahii和T. jirovecii的共用引物，在進(jìn)行特異性驗(yàn)證中，上述兩株目的菌株可成功擴(kuò)增，檢測(cè)敏感性為102CFU/ml。近期，Sting 等[36]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR 聯(lián)合Sanger 法測(cè)序?qū)?xì)菌和真菌進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定，擴(kuò)增過(guò)程中用SYBR green I 作為熒光染料，通過(guò)對(duì)D1、D2 區(qū)和ITS 區(qū)的分別和聯(lián)合序列比對(duì)，將研究中兩株菌鑒定為T(mén).asahii。

TaqMan 探針?lè)ň哂懈叨忍禺愋?，利用Taq 酶的外切核酸酶活性，探針被切斷后產(chǎn)生熒光信號(hào)。2007年，Mekha 等[37]基于IGS1 區(qū)設(shè)計(jì)并應(yīng)用T.asahii特異性引物和TaqMan 探針，可以將T.asahii與T.asteroids、T.coremiiformis、T. faecale、T. mucoides4 個(gè)菌種區(qū)分開(kāi)，且實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床樣本中T.asahii的定量分析。分子信標(biāo)是一種新型的熒光探針，結(jié)合靶序列后分子信標(biāo)的環(huán)狀變?yōu)殒湢?，此時(shí)熒光分子與猝滅分子距離增大，所產(chǎn)生熒光可以被檢測(cè)到，具有高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)。Kumar 等[38]通過(guò)在實(shí)時(shí)熒光PCR 中應(yīng)用4 種分子信標(biāo)，對(duì)多個(gè)種屬真菌不同分子信標(biāo)Tm 值進(jìn)行觀察分析，得出了兩種分子信標(biāo)對(duì)于T.asahii的特征性Tm 值，并通過(guò)該特征性Tm 值在臨床樣本中成功檢測(cè)出T.asahii。但該研究未進(jìn)行T.asahii和毛孢子菌屬中其他種的Tm 值比較，故尚不能完全確定該法對(duì)T. asahii檢測(cè)和鑒定的準(zhǔn)確程度。

2.5 基于PCR技術(shù)的其他方法

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是以PCR 和DNA 序列分析為基礎(chǔ)，通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物的特定位點(diǎn)進(jìn)行酶切，在電泳中可得到特異性的電泳譜帶，從而對(duì)基因分型進(jìn)行鑒定。針對(duì)毛孢子菌進(jìn)行PCR-RFLP 的研究較為有限，且多涉及動(dòng)物和食品加工領(lǐng)域。Sadrossadati 等[39]在對(duì)念珠菌血癥患者進(jìn)行ITS 區(qū)基因多態(tài)性分析后，204 份陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中共鑒定出3 份樣本為T(mén). asahii。Attchelouwa等[40]通過(guò)對(duì)發(fā)酵食品中的菌株進(jìn)行PCR-RFLP 分析，應(yīng)用Hae III, Hinf I 和 Cfo I 對(duì)ITS 區(qū)和D1/D2區(qū)的多態(tài)性進(jìn)行分析，成功檢測(cè)到T. asahii和T.coremiiforme。到目前為止，在PubMed 官網(wǎng)可檢索到的關(guān)于涉及毛孢子菌限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的文獻(xiàn)中，均為針對(duì)ITS 區(qū)的相關(guān)分析，且無(wú)應(yīng)用IGS1 區(qū)序列進(jìn)行種水平鑒定的比對(duì)，因此無(wú)法確定上述文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于毛孢子菌鑒定結(jié)果是否準(zhǔn)確。

隨著基因工程研究的不斷深入，核酸分子雜交技術(shù)的方法不斷被應(yīng)用于毛孢子菌的檢測(cè)和鑒定中。Southern 印跡雜交技術(shù)可通過(guò)將待測(cè)核酸分子與核酸同位素標(biāo)記探針的雜交實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，Nagai 等[41]針對(duì)毛孢子菌26S 區(qū)設(shè)計(jì)特異性內(nèi)外引物，應(yīng)用巢氏PCR 對(duì)臨床樣本中的毛孢子菌種進(jìn)行了成功檢測(cè)，并結(jié)合Sourthern 印跡雜交技術(shù)將臨床常見(jiàn)的兩種致病菌種T. asahii和T. mucoides進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)11 份經(jīng)組織學(xué)診斷為播散性毛孢子菌病的血清樣本驗(yàn)證，敏感性為64%。狹縫印跡雜交是從Southern 印跡雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，Loeffler 等[42]應(yīng)用狹縫印跡雜交法（slot blot hybridization）對(duì)酵母菌進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用基于ITS 區(qū)設(shè)計(jì)的T. cutaneum種特異性探針成功檢測(cè)到該菌。

DNA 微陣列芯片法基于反向雜交技術(shù)，固定在芯片的探針與待檢測(cè)核酸片段雜交可產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)間接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行判斷。Spiess 等[33]通過(guò)應(yīng)用DNA 微陣列芯片法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)多種致病真菌及臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，該研究基于ITS區(qū)設(shè)計(jì)了T. asahii的特異性引物和探針。Hsiue 等[43]通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)5 種毛孢子菌種的ITS 區(qū)探針，從116 例血培養(yǎng)呈真菌陽(yáng)性的血液樣本中成功檢測(cè)出2 例樣本中的T. asahii。該法較為適用于高通量檢測(cè)，而面對(duì)臨床樣本量較少的檢測(cè)需求時(shí)，成本往往較高。Luminex 液相芯片技術(shù)通過(guò)標(biāo)記在微球上標(biāo)記熒光染料，同時(shí)微球可以結(jié)合特異性探針，通過(guò)紅色激光激發(fā)熒光以鑒定微球種類，再通過(guò)綠色激光激發(fā)報(bào)告分子，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。Diaz 等[44]應(yīng)用Luminex 100 技術(shù)和基于D1D2、ITS、IGS 區(qū)設(shè)計(jì)的48 條特異性探針對(duì)34 個(gè)毛孢子菌種進(jìn)行檢測(cè)，種間的有效區(qū)分精細(xì)度達(dá)1 bp，可在50 min 內(nèi)完成高通量檢測(cè)。

3 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

該技術(shù)于2000 年問(wèn)世，需應(yīng)用4 對(duì)特異性引物，在鏈置換DNA 聚合酶的作用下于恒溫條件下完成擴(kuò)增[45]。該技術(shù)可在60 ～65℃的恒溫下，經(jīng)過(guò)30 ～60 min 擴(kuò)增獲得指數(shù)級(jí)核酸分子拷貝增量。LAMP 技術(shù)不需要常規(guī)PCR 的熱循環(huán)和溫度升降，操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速，通過(guò)加入熒光染料還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，也可以通過(guò)肉眼觀察熒光為擴(kuò)增結(jié)果定性。2014 年，Kasahara 等[46]報(bào)道應(yīng)用LAMP 技術(shù)對(duì)機(jī)會(huì)性病原酵母菌進(jìn)行檢測(cè)，研究中針對(duì)T. asahii和T. mucoides設(shè)計(jì)了IGS1 區(qū)的種特異性引物，并用除上述兩菌種外的12 個(gè)毛孢子菌近源菌種檢測(cè)特異性，結(jié)果顯示只檢測(cè)到目標(biāo)菌種，T. asahii和T. mucoides純培養(yǎng)的檢測(cè)靈敏度分別為1.3CFU/ml 和1.6×102CFU/ml。上述研究中僅將3 株T. asahii和1 株T. mucoides作為實(shí)驗(yàn)菌株，其檢測(cè)特異性尚需更大樣本量的研究驗(yàn)證。Zhou 等[47]將15 株T. asahii和14 株近源菌株作為L(zhǎng)AMP 檢測(cè)菌株，基于IGS1 設(shè)計(jì)T. asahii種特異性引物，通過(guò)感染小鼠模型和臨床樣本完成特異性驗(yàn)證，成功建立了可以直接應(yīng)用于臨床樣本的T. asahii的LAMP 快速檢測(cè)方法，該研究還實(shí)現(xiàn)了以熒光染料為基礎(chǔ)的可視化結(jié)果判讀。

3.2 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）

RCA 技術(shù)是一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用DNA 或RNA 聚合酶使引物沿閉合環(huán)狀模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而得到長(zhǎng)單鏈DNA 或RNA，包括鎖式探針擴(kuò)增、線性擴(kuò)增、指數(shù)擴(kuò)增和多引物滾環(huán)擴(kuò)增[48]。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，最關(guān)鍵的步驟是目的核酸鏈特異性成環(huán)，這是擴(kuò)增開(kāi)始的必要條件，同時(shí)可以應(yīng)用具有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針完成特異性實(shí)時(shí)檢測(cè)。RCA技術(shù)對(duì)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)敏感性較高，適用于對(duì)種水平特別是種系發(fā)生關(guān)系較近的菌種進(jìn)行區(qū)分[49,50]。Xiao 等[51]分別應(yīng)用RCA 技術(shù)和基于PCR 的反向線性點(diǎn)（reverse line blot，RLB）雜交技術(shù)對(duì)T.asahii、T. cutaneum、T. dermatis、T. domesticum、T.inkin、T. japonicum、T. jirovecii和T. laibachii8 個(gè)毛孢子菌種的48 株菌株進(jìn)行檢測(cè)，該研究基于ITS 區(qū)和D1、D2 區(qū)設(shè)計(jì)種特異性探針，結(jié)果顯示RCA 可以將所有研究菌株準(zhǔn)確鑒定至種水平，而RLB 技術(shù)不能直接將T. dermatis和T. japonicum鑒定至種水平，需要通過(guò)與近源菌株（T. dermatis和T. jirovecii、T.asahii和T. japonicum）探針相結(jié)合檢測(cè)進(jìn)行排除后確定菌種，該研究顯示出RCA 技術(shù)在近源菌株種間鑒定研究中的優(yōu)勢(shì)。RCA 技術(shù)檢測(cè)的整體過(guò)程需要數(shù)小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，第一步的成環(huán)過(guò)程需根據(jù)不同連接酶設(shè)置不同的高溫條件，擴(kuò)增溫度根據(jù)不同的擴(kuò)增類型而不同，較常用的擴(kuò)增溫度為30℃。與LAMP技術(shù)相比，雖然RCA 技術(shù)在反應(yīng)條件和時(shí)間上沒(méi)有前者更為簡(jiǎn)化，但其不需要過(guò)多的引物引發(fā)，產(chǎn)物較為單一，同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)與展望

上述各種NAAT 的出現(xiàn)和應(yīng)用，可使毛孢子菌感染的診斷較以往的形態(tài)學(xué)鑒定和生化特性檢測(cè)方法更加有針對(duì)性，給毛孢子菌感染的診斷和菌種鑒定提供了寬廣的發(fā)展空間。以PCR 為代表的變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)仍是目前毛孢子菌鑒定工作的主流技術(shù)，不同類型PCR 技術(shù)的應(yīng)用選擇往往取決于研究目的和待測(cè)菌量差異，如針對(duì)臨床組織樣本中微量毛孢子菌的檢測(cè)常選用巢氏PCR 技術(shù)，針對(duì)毛孢子菌的多菌種鑒定或多靶基因擴(kuò)增常選用多重PCR 技術(shù)，上述兩種技術(shù)與常規(guī)PCR 技術(shù)都可以實(shí)現(xiàn)毛孢子菌的定性檢測(cè)。對(duì)于需要對(duì)毛孢子菌進(jìn)行定量分析研究時(shí)，則可選用實(shí)時(shí)熒光PCR。而對(duì)于高通量的毛孢子菌檢測(cè)或鑒定工作，可選用PCR 與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合的方法，特別是DNA 微陣列芯片法在今后高通量致病菌檢測(cè)中的表現(xiàn)更值得期待。與變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比而言，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在一定程度上擺脫了特定變溫設(shè)備的限制，具有在常規(guī)恒溫設(shè)備或環(huán)境中的應(yīng)用潛力，其便捷、快速、不依賴特殊設(shè)備等優(yōu)勢(shì)較適用于目前毛孢子菌感染零散發(fā)病的臨檢需求。

同時(shí)，目前NAAT 在毛孢子菌研究中的應(yīng)用仍存在可改進(jìn)和優(yōu)化的空間，如樣本準(zhǔn)備和處理流程較為復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，令NAAT 不能發(fā)揮出時(shí)效性優(yōu)勢(shì)；基于IGS1 區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增的研究數(shù)量仍為少數(shù)，使得既往很多研究中毛孢子菌菌種鑒定結(jié)果的可信度下降；目前絕大多數(shù)NAAT 技術(shù)對(duì)特定設(shè)備的依賴性依然較高，限制了基于NAAT 的檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用。因此，應(yīng)著眼于縮短檢測(cè)的總體耗時(shí)，特別是在簡(jiǎn)化樣本準(zhǔn)備和處理流程、降低NAAT 對(duì)特定設(shè)備的依賴性、簡(jiǎn)化結(jié)果判讀方法等三個(gè)方面進(jìn)行深入研究，開(kāi)發(fā)新的方法或優(yōu)化已有方法，以實(shí)現(xiàn)基于NAAT 的毛孢子菌感染的快速診斷。