朱嶼倩，吳凌云

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233

血液系統(tǒng)惡性腫瘤是一種造血細胞的惡性克隆性疾病，通常表現(xiàn)為造血細胞出現(xiàn)增殖失控和分化障礙，具有異質性高、預后較差等特點，迄今為止尚缺乏有效的治愈方法。血液腫瘤的發(fā)生是一種復雜的多步驟過程，多年來的研究[1-2]顯示，其發(fā)病與基因組異常、表觀遺傳學改變、骨髓造血微環(huán)境調節(jié)異常和免疫系統(tǒng)紊亂等多種因素有關。

表觀遺傳修飾是一種影響基因轉錄及翻譯而核苷酸序列不發(fā)生改變的基因表達調控方式，能夠在DNA和染色質結構修飾、RNA穩(wěn)定性以及轉錄活性水平上進行調控進而影響基因表達，其內容主要包括DNA甲基化修飾、組蛋白共價修飾、染色質重塑和RNA干擾等。目前，以N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾為代表的表觀轉錄組學已成為研究熱點，即針對其在轉錄組水平上的表觀遺傳學改變進行研究。與DNA甲基化相似，m6A甲基化修飾可在不改變堿基序列的條件下介導基因表達的轉錄后調控。近年來隨著高通量m6A測序技術的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)m6A及其相關因子通過調節(jié)骨髓造血微環(huán)境中多能干細胞的自我更新、增殖與分化，參與骨髓的造血發(fā)育。新近的研究[3]表明，m6A修飾異常與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關。本文就m6A甲基化修飾的生物學特征、造血調控功能以及其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中作用的研究進展進行綜述，為開發(fā)基于m6A修飾異常的相關血液腫瘤新的分子靶向療法提供科學依據(jù)。

1 m6A甲基化修飾的生物學特征

1.1 m6A甲基化修飾的酶系統(tǒng)

m6A是位于腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾，為真核生物mRNA最常見的一種修飾方式。m6A甲基化修飾廣泛分布于mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）中，在mRNA剪接、微小RNA（microRNA，miRNA）的加工成熟、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）介導的轉錄抑制等多種RNA的代謝過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。m6A最早于1974年在肝癌細胞的mRNA中被發(fā)現(xiàn)[6]，此后亦在小鼠、酵母等多種真核生物中被檢測，其生物學功能涉及細胞分化、有絲分裂、免疫穩(wěn)態(tài)等多個方面。m6A甲基化修飾是動態(tài)可逆的酶促反應過程，mRNA在編碼器（writer）即m6A甲基轉移酶的催化下發(fā)生甲基化，這一過程可在消碼器（eraser）即m6A去甲基化酶的催化下被逆轉，且甲基化的mRNA能夠被讀碼器（reader）即m6A結合蛋白識別。m6A甲基轉移酶為由甲基轉移酶樣3（methyltransferase like 3，METTL3）、METTL14及Wilms′腫瘤蛋白1相關蛋白（Wilms′ tumor 1-associating protein，WTAP）等組成的巨型復合物。在催化m6A形成的過程中，METTL14與METTL3形成異二聚體發(fā)揮催化作用，并在WTAP的招募下結合到mRNA上，調控m6A修飾水平的動態(tài)變化[7]。m6A去甲基化酶的成分主要包括脂肪量和肥胖相關（fat mass and obesity associated，F(xiàn)TO）基因和α-酮戊二酸依賴的加雙氧酶ALKB同源蛋白5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5）[8-9]。 與 DNA甲基化相似，m6A甲基轉移酶與去甲基化酶通過調控mRNA序列m6A甲基化修飾的動態(tài)變化來影響轉錄后的基因表達水平。m6A結合蛋白的成分包括YTH結構域蛋白家族成員和異質性胞核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）[10-11]；其中，前者包括YTHDF（YTH domain family protein）和YTHDC（YTH domain containing）共2個亞型，YTHDF亞型的結合蛋白分別為YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，而YTHDC亞型的結合蛋白為YTHDC1和YTHDC2。m6A結合蛋白通過識別甲基化的mRNA發(fā)揮不同的生物學功能，例如YTHDF1主要影響m6A修飾基因的翻譯效率以促進蛋白質合成[11]，而YTHDF2則介導靶基因mRNA的降解以調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性[10]從而調控體細胞基因表達水平。目前，m6A修飾酶的種類和生物學功能尚未被完全闡明，而m6A新的修飾酶如METTL16、KIAA1429等被相繼報道[12]，可見m6A甲基化修飾的動態(tài)調控機制及其潛在的生物學功能依然具有廣闊的探索空間。

1.2 m6A甲基化修飾的上游調控因素

m6A的分布在真核生物中非常保守，近年來利用高通量m6A測序技術揭示mRNA的m6A甲基化修飾主要分布于終止密碼子、3′非翻譯區(qū)（3′-untranslated regions，3′-UTRs）以及長外顯子區(qū)域，且m6A的核心序列為RRACH保守序列（R通常為A和G，H通常為A、C和U）[13-15]。另外，92%～96%的m6A修飾區(qū)域能夠與miRNA反向互補，提示miRNA可以通過與mRNA序列互補配對參與調節(jié)mRNA的m6A修飾的發(fā)生[16]。miRNA是真核生物中一類長度為18～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其在基因表達的轉錄后調控中可發(fā)揮關鍵作用。成熟的miRNA可通過與Argonaute蛋白（Argonaute protein，AGO）形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complexes，RISCs），并引導RISCs通過堿基互補與miRNA具有同源性的靶mRNA結合，引起靶基因mRNA的降解或翻譯受阻而抑制腫瘤生長相關基因的表達[17]，從而實現(xiàn)對機體生長、發(fā)育及腫瘤生成等細胞生物學過程的調控。miRNA的成熟需要miRNA前體內切酶Dicer（屬于RNase Ⅲ家族）的參與[18]。Chen等[16]通過在HeLa細胞中敲低Dicer以降低miRNA的水平后發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化修飾的水平顯著下降，而過表達Dicer上調miRNA水平則增加了m6A甲基化修飾，且在該過程中METTL3、FTO、ALKBH5的表達水平均未受影響，繼而提示Dicer可通過影響miRNA的生成調節(jié)mRNA的m6A修飾水平。

2 m6A甲基化修飾與髓系造血調控

2.1 m6A甲基化修飾調控造血干/祖細胞的分化

造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）是一類具有長期自我更新能力和分化潛能的多能干細胞。HSPCs分化出的成熟血細胞包括髓系和淋系兩大類，前者包括粒系細胞、紅系細胞、單核系細胞以及巨核系細胞，后者包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell，NK細胞）[19]。機體的造血過程起始于胚胎發(fā)育早期，其間受到嚴格調控，一旦在造血過程中出現(xiàn)了基因突變、染色體易位等遺傳學改變使HSPCs分化受阻或增生異常，均會導致血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生[20]。脊椎動物的HSPCs由生血內皮（hemogenic endothelial，HE）細胞經過內皮-造血轉化（endothelial-tohematopoietic transition，EHT）過程產生[21]。Zhang等[22]在斑馬魚的血液及血管組織中發(fā)現(xiàn)，m6A可通過YTHDF2介導notch1a mRNA的降解，影響EHT過程中HE細胞基因表達的平衡而調控HSPCs的分化過程；該研究還發(fā)現(xiàn)，mettl3 缺失可通過降低notch1a mRNA的m6A甲基化修飾水平來抑制EHT過程，從而阻礙HSPCs的生成。此外，在敲低Mettl3 的小鼠模型中亦出現(xiàn)類似表型[23]。上述研究均提示，m6A甲基化修飾與HE細胞基因表達的平衡調控密切相關。

2.2 m6A甲基化修飾調控骨髓間充質干細胞的分化

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中不同于HSPCs的另一類干細胞，具有自我更新及多向分化潛能，可在不同的誘導條件下分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等多種骨髓基質細胞[24]。Yao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，METTL3以m6A甲基化依賴性方式調節(jié)BMSCs中Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）的表達，而YTHDF2則通過調節(jié)JAK1基因mRNA的穩(wěn)定性影響JAK1的表達水平；同時該研究提出，降低BMSCs中JAK1基因mRNA的m6A水平可通過調控Janus激酶1/信號轉導及轉錄激活因子5/CCAAT啟動子/增強子結合蛋白β（Janus kinase 1/signal transducer and activator of transcription 5/the promoter of CCAAT/enhancer binding proteinβ，JAK1/STAT5/C/EBPβ）信號途徑促進BMSCs向脂肪細胞分化。BMSCs是造血微環(huán)境中的多潛能基質細胞，參與調節(jié)骨髓造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，其可通過合成和分泌多種造血因子促進HSPCs的自我更新、增殖及分化，進而維持造血過程的平衡。成骨細胞具有維持HSPCs活性的能力，亦參與維持機體正常的造血功能。在Wu等[15]構建的Mettl3基因敲除的小鼠模型中，小鼠骨骼出現(xiàn)骨質疏松癥的相關病理表型，提示Mettl3介導的m6A甲基化修飾在調節(jié)BMSCs分化過程中發(fā)揮了一定作用；該研究還發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素受體-1（parathyroid hormone/parathyroid hormone receptor-1，PTH/PTH1R）是m6A的下游信號通路，且Mettl3缺失僅在翻譯水平上抑制PTH1R的表達，繼而表明m6A可通過調節(jié)PTH/PTH1R信號途徑影響B(tài)MSCs的成骨和成脂分化過程。

2.3 m6A甲基化修飾調控細胞重編程

細胞重編程是終末分化的細胞在特定條件下逆轉為原始多能或全能干細胞的過程，而誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）則是指體細胞在轉入八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、SRY 盒 式 蛋 白 2（SYR-box 2，Sox2）、v-myc鳥類骨髓細胞瘤病毒原癌基因同源蛋白（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc）及Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor 4，Klf4）共4種轉錄因子后，被轉化為具有胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）特征的細胞[26]。Chen等[16]研究顯示，在表達4種多能性因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4的小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中過表達Mettl3可使m6A水平升高，且Mettl3過表達的MEF細胞中OCT4、SOX2、NANOG同源框蛋白多能性因子表達增加，這提示m6A可調控體細胞內多能性因子的表達水平，從而促進體細胞重編程為多能干細胞。c-MYC是正常造血細胞和白血病細胞自我更新與分化的主要調節(jié)因子，METTL3亦可通過增加c-Myc基因mRNA的m6A修飾水平提高白血病細胞中c-MYC蛋白的表達量[27-28]，進而抑制細胞分化并促進白血病細胞的自我更新，發(fā)揮在血液腫瘤中的致癌作用。

3 m6A甲基化修飾與血液系統(tǒng)惡性腫瘤

3.1 m6A甲基化修飾在急性髓系白血病中的作用

急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種具有高度異質性的HSPCs惡性克隆性增生的髓系腫瘤，是最為常見的成人急性白血病類型。白血病細胞以自我更新增強、增殖失控、分化受阻和凋亡受抑為特征，在骨髓中增殖累積導致正常造血細胞減少。在分子水平上，AML的發(fā)生遵循“多次打擊”的模式[1]。m6A相關組分失調可誘導癌基因表達，促進惡性腫瘤的發(fā)生[28-29]，并通過加強AML細胞的自我更新能力在AML進展中發(fā)揮重要作用。Vu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，METTL3在AML細胞中呈高表達，并可介導m6A甲基化修飾促進AML細胞增殖、抑制細胞分化，在AML中發(fā)揮致癌作用；下調METTL3基因則可通過升高蛋白激酶B（phosphate protein kinase B，PKB/AKT）的磷酸化水平誘導AML細胞分化及凋亡，而對于正常造血細胞的凋亡無誘導作用；同時該研究還發(fā)現(xiàn)，m6A修飾可通過提高AML細胞中c-MYC、B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，BCL2）基因和第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）基因mRNA的翻譯水平發(fā)揮致癌作用，從而進一步說明METTL3可作為髓系惡性腫瘤的致癌因子，對臨床治療具有重要的參考價值。METTL14為m6A甲基轉移酶復合物的另一重要組分，Weng等[30]研究表明，METTL14在AML細胞中亦呈高表達，可通過介導m6A甲基化修飾阻斷正常髓系細胞的分化、促進惡性造血，在正常骨髓生成與AML的發(fā)病機制中均發(fā)揮關鍵作用。以METTL3與METTL14為代表的m6A相關因子異?？赡苁茄合到y(tǒng)腫瘤發(fā)生的潛在因素，這為其臨床診療提供了新的方向。

3.2 m6A甲基化修飾在骨髓增生異常綜合征中的作用

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一組以骨髓造血細胞發(fā)育異常、病態(tài)造血以及外周血細胞計數(shù)減少為特征的惡性克隆性疾病，且具有較高的向白血病轉化的風險[2]。細胞的發(fā)育過程包括細胞增殖與分化，而由MDS引起的骨髓造血細胞發(fā)育異常表現(xiàn)為在MDS早期即呈現(xiàn)出細胞分化障礙和過度凋亡，且在疾病進展時異常細胞表現(xiàn)出凋亡抵抗[31]。目前的研究普遍認為，MDS的發(fā)生與發(fā)展是多個基因事件的累積損傷，且基因組異常與表觀遺傳修飾改變的共同作用可引起MDS的表型異質性[2]，其中相關基因的表達水平改變可能影響MDS骨髓造血細胞中的關鍵癌基因或抑癌基因，使得異常造血細胞獲得克隆性增殖優(yōu)勢。既往研究[32]表明，RNA剪接體編碼基因可能作為早期驅動基因參與MDS的發(fā)生與發(fā)展過程。剪接體的微小改變可影響剪接的特異性，引起轉錄蛋白多肽序列的改變，進而影響造血細胞的正常生理功能，但迄今為止由異常RNA剪接所誘發(fā)MDS的確切機制尚不清楚。YTHDC1定位于細胞核，可通過募集前體mRNA剪接因子介導mRNA的剪接過程[33]，這有助于闡明剪接異常在MDS異常造血功能中的作用。另外，下調METTL3基因所引起的m6A修飾水平降低可改變前體mRNA選擇性剪接（alternative splicing，AS）模式，而該過程主要富集于p53信號通路和細胞凋亡通路中[13-14]。因此，上述結果進一步說明m6A甲基化修飾對于MDS異常剪接機制的探索具有重要意義。

基于m6A的骨髓造血調控功能，對于維持骨髓正常的造血過程具有重要作用。骨髓是機體造血的主要場所，骨髓造血功能的調控異?？蓪е乱幌盗屑膊〉陌l(fā)生。遺傳性骨髓衰竭綜合征（inherited bone marrow failure syndromes，IBMFS）是一組異質性遺傳性疾病，以骨髓造血功能衰竭、先天性畸形以及向惡性腫瘤進展的風險高為共同臨床特征[34]，主要包括范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）、先天性角化不良（dyskeratosis congenita，DC）、戴 - 布二氏貧血（Diamond-Blackfan anemia，DBA）和舒 - 戴二氏綜合征（Shwachman-Diamond syndrome，SDS）等，其中FA是由于DNA修復機制缺陷所致，而DC則是由端粒酶缺陷引起，二者均具有獲得基因改變并發(fā)展為MDS的傾向。IBMFS的血液系統(tǒng)病變表現(xiàn)為骨髓造血功能受損、全血細胞或單系細胞減少，這提示IBMFS病變是來源于髓系多能干細胞水平。m6A及其相關因子可通過顯著影響骨髓造血發(fā)育參與IBMFS的發(fā)生與發(fā)展過程，但其確切作用機制尚待進一步研究闡明。

3.3 m6A甲基化修飾與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療

血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是多步驟的病態(tài)過程，由于腫瘤存在緩解率較低、復發(fā)率較高以及復發(fā)后難治等問題，患者通常預后不良。傳統(tǒng)化學治療（化療）方案耐藥發(fā)生率較高，是血液腫瘤患者難治復發(fā)的根源之一，而采用多種療法的聯(lián)合使用則可提高臨床療效。程序性死亡受體 -1（programmed death-1，PD-1）作為免疫檢查點廣泛表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞和多種腫瘤細胞表面，與細胞凋亡密切相關。程序性死亡配體 -1（programmed death ligand-1，PD-L1）是 PD-1的主要配體，二者結合后可從多個層面抑制機體的抗腫瘤免疫應答。針對PD-1/PD-L1位點的免疫治療已應用于多種惡性腫瘤，通過阻斷PD-1/PD-L1信號途徑可改善機體的免疫抑制狀態(tài)，增強抗腫瘤免疫應答[35]。去甲基化藥物，如DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制劑地西他濱與阿扎胞苷，目前已廣泛應用于臨床，研究[36]結果顯示該2種藥物通過上調AML與MDS患者PD-1、PD-L1的表達水平介導AML與MDS耐藥，從而提示PD-1/PD-L1抑制劑可提高髓系惡性腫瘤患者對去甲基化藥物的敏感性。Han等[37]的報道指出Ythdf1缺陷型（Ythdf1-/-）小鼠相較于野生型小鼠表現(xiàn)出更強的抗腫瘤免疫應答，而阻斷PD-L1亦可促進Ythdf1-/-小鼠的抗腫瘤免疫應答反應，從而揭示了m6A相關蛋白抑制劑與免疫療法的聯(lián)合使用在血液系統(tǒng)惡性疾病的治療中具有廣闊的應用前景。

Li等[38]研究表明，F(xiàn)TO在AML中起著致癌作用，其作為去甲基化酶可通過降低m6A修飾水平促使AML的發(fā)生，并抑制全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）誘導下的異?？寺∠蛘Ｔ煅毎只?。Huang等[39]研究顯示，F(xiàn)TO抑制劑在體外可顯著抑制AML細胞增殖并促進AML細胞分化和凋亡，因而靶向抑制FTO有望成為治療AML的新策略。另外，針對m6A甲基轉移酶關鍵組分METTL3與METTL14的靶向治療，有助于提高血液系統(tǒng)惡性疾病化療藥物的敏感性。阻斷METTL3活性的小分子抑制劑聯(lián)合FMS- 樣酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）和異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）2 種化學抑制劑可能是治療髓系惡性腫瘤的一種新方法[27]；靶向METTL14的小分子抑制劑聯(lián)合標準分化誘導劑，可增強白血病患者的化療敏感性[30]。目前，異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效治療方式[40]，但allo-HSCT往往伴隨一系列的治療并發(fā)癥，其中移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）是allo-HSCT患者的主要并發(fā)癥，亦是引起患者非復發(fā)死亡的主要原因。近年來的研究[41]顯示，BMSCs是防治GVHD的有效方法，且BMSCs聯(lián)合造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的移植可促進移植后患者的造血恢復。因此，基于m6A修飾相關的多能干細胞分子調控機制的進一步研究，或將為血液系統(tǒng)惡性疾病患者提供更多的可移植干細胞帶來福音。

4 總結與展望

m6A修飾是真核生物RNA中廣泛存在的一種甲基化修飾方式，m6A及其相關因子對惡性腫瘤影響的相關研究是RNA表觀遺傳學研究的熱點，但目前m6A相關蛋白種類和功能的研究仍處于探索階段。基于上述的研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化修飾能夠影響血液系統(tǒng)惡性腫瘤多能干細胞的自我更新、增殖以及分化過程，但其在正常造血及惡性血液病中確切的生物學功能尚不明確。同時，關于m6A甲基化修飾調控造血系統(tǒng)以及誘發(fā)血液腫瘤的分子機制尚需進一步闡明，這對于深入認識血液系統(tǒng)惡性腫瘤的致病機制、探索新的靶向干預具有重要意義。