孫薏雯,李金寶,楊丹丹,于海洋,劉祎良,周 敏,孔心茹,劉 飛,徐 娜

濟寧醫(yī)學院 生物科學學院,山東 日照 276800

生物體內存在的RNA 主要分為編碼RNA 和非編碼RNA，即直接參與編碼蛋白質的RNA 和不具有編碼蛋白質功能、或者間接參與翻譯過程的RNA。起初認為非編碼RNA 是轉錄的副產物，不具有生物學功能，但隨著科技的進步和研究的深入，非編碼RNA 的角色發(fā)生了很大的變化，其在動、植物的多個生物進程中都發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[1-3]。長鏈非編碼RNA lncRNA（long noncoding RNA）是一類長度大于200 nt 的非編碼RNA[4]。迄今為止，lncRNA 在動物中的研究報道較多，其在細胞的增殖、分化、個體發(fā)育及腫瘤發(fā)生等多個生物學過程中發(fā)揮作用[5-10]。相比之下，lncRNA 在植物中的研究還非常有限。本文圍繞近年來國內外對lncRNA 的研究成果，就其在植物中的產生、特點、功能及其發(fā)揮作用的分子機制進行了系統(tǒng)地總結，以期為未來lncRNA 在植物中的研究提供參考。

1 LncRNA 的概述

人類基因組中約有93%的DNA 可以被轉錄為RNA，而這些RNA 中用在編碼蛋白質方面的比例只有2%左右，剩下的RNA 根本不具備編碼蛋白潛能或編碼能力較低[11]，這些RNA 被稱為非編碼RNA。根據非編碼RNA 的長度可以將其分為3 大類：長度小于50 nt 的microRNA、siRNA、piRNA等；長度在50 nt～200 nt 的rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 等；長度大于200 nt 的長鏈非編碼RNA（lncRNA）。人類DNA 元件百科全書發(fā)現，lncRNA 占總RNA 的4%～9%[1]，這一發(fā)現證明了lncRNA的重要性，且越來越多的研究表明其在多個生物進程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。長鏈非編碼RNA 廣泛存在于真核生物中，多數lncRNA 的結構與mRNA 類似，具有帽子結構和polyA 尾巴，其轉錄是由RNA 聚合酶II 完成的；還有一部分lncRNA 的轉錄可以由RNA 聚合酶III/IV/V 的作用完成，其主要作為小干擾RNA（siRNA）的前體RNA 或參與介導基因轉錄沉默等[12,13]。有研究表明，人類的lncRNA 有兩種：含poly(A)+及不含poly(A)-[14]。基于此，有研究對擬南芥的幼苗進行不同的脅迫處理，且對所獲得的材料進行RNA-seq 測序，檢測上述兩類lncRNAs。經分析發(fā)現，與poly(A)+的lncRNAs 相比，poly(A)-的lncRNAs 的長度更短、表達量更低、對脅迫響應的特異性更強[15]。

1.1 植物中l(wèi)ncRNA 的分類

根據lncRNA 的基因組起源在染色體上與編碼基因的相對位置來分，通常有以下幾種：起源于兩個基因之間的區(qū)域的lncRNA，即基因間長鏈非編碼RNA（Intergenic non coding RNA，lincRNA）；起源于啟動子區(qū)域啟動子的lncRNA，即啟動子相關長鏈非編碼RNA（Promoter-associated lncRNA）；起源于非翻譯區(qū)的lncRNA，即非編碼區(qū)相關的lncRNA(UTR associated lncRNA）；起源于內含子區(qū)域的lncRNA，即內含子長鏈非編碼RNA（Intronic lncRNA）；除此之外，還有起源于反義長鏈的非編碼RNA（Antisense lncRNA），與之相對，還存在正義長鏈非編碼RNA,即從具有相同啟動子的蛋白編碼基因重疊區(qū)域轉錄來的lncRNA[16,17]。

1.2 LncRNA 的特點

LncRNA 雖然不具有編碼蛋白質的能力，但本質上仍是由核苷酸組成的RNA 長鏈。（1）lncRNA最顯著的特點即“長”和無編碼蛋白質的能力，且與編碼RNA 類似，多數具有poly A 尾巴和啟動子結構；（2）lncRNA 有組織與空間特異性，不同組織或處于相同組織不同生長階段的lncRNA 的表達均不相同；（3）調控多樣性，lncRNA 可以從轉錄前、轉錄中和轉錄后等多個方面對基因的表達調控造成影響；（4）序列保守性低，lncRNA 的物種間差異較大，不同物種之間很少找到相似的lncRNA；（5）lncRNA 的所在位置比較集中，主要分布于細胞核中，表達水平與mRNA 比相對較低。lncRNA的這些特點決定了它在植物中發(fā)揮的作用與機制。

2 LncRNA 調控植物的生長和生殖發(fā)育

隨著二代測序的快速發(fā)展，越來越多的lncRNA 被鑒定出來，但由于lncRNA 調控機制的復雜多樣性，使得植物中l(wèi)ncRNA 功能的研究進展十分有限。已有的研究發(fā)現些lncRNA 對植物的生長和生殖發(fā)育都具有非常重要的調節(jié)作用。

2.1 LncRNA 在植物中的功能

光是植物正常生長發(fā)育所需的一個重要的環(huán)境因子。植物的光形態(tài)建成是一個受轉錄和轉錄后水平調控的復雜過程。Wang Y,et al.[18]發(fā)現了第一個在持續(xù)紅光條件下（cR）能促進光形態(tài)建成的lncRNAHID1（HIDDEN TREASURE 1）。在cR 條件下，lncRNAHID1表達敲除的突變體hid1中，光形態(tài)建成的關鍵抑制基因PIF3的轉錄水平顯著提高，使得突變體的下胚軸明顯比野生型顯著增長[19]。對HID1的二級結構進行預測發(fā)現其有兩個莖環(huán)結構，且這兩個莖環(huán)結構對cR 條件下幼苗的下胚軸生長都具有調節(jié)作用。此外，HID1可以與核蛋白形成大的復合物，該復合物可直接結合至PIF3的第一個內含子區(qū)并抑制PIF3的轉錄，進而調控幼苗的光形態(tài)建成。

氮素是植物生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)元素之一，提高作物的氮素利用率對農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義。Liu F,et al.[20]結合RNA-seq 測序和qPCR 技術鑒定出6 個受強烈誘導的lncRNAs，并對誘導量最高的lncRNAT5120的功能進行了深入的探索。研究發(fā)現T5120過表達系中響應基因的誘導量明顯升高，表明T5120調控植物對的響應。進一步的研究結果顯示，轉錄因子NLP7 可以結合T5120的啟動子并調控其表達，T5120作用于NLP7 的下游調控信號。同時，T5120過表達系的硝態(tài)氮還原酶活性和氨基酸含量明顯升高，表明T5120能增強植物的同化能力。此外，過表達T5120可以提高植物的生物量，促進根系發(fā)育，從而改善植物的生長。

AtR8lncRNA 是由RNA 聚合酶Ⅲ轉錄而來的，其長度約為260 nt，主要在植物的根中及培養(yǎng)細胞的細胞質中大量積累[21]。根中AtR8的表達量受低氧脅迫以及水楊酸處理的影響[22]。研究發(fā)現，在低濃度（20 μM）水楊酸處理下，atr8突變體的主根長度明顯比野生型短，說明在水楊酸脅迫條件下AtR8可以調控主根的生長[22]。與AtR8同源性最高的lncRNA 是甘藍中的BoNR8，兩者的同源性達到了78%[23]。BoNR8同樣是由RNA 聚合酶Ⅲ轉錄產生的，其長度為272 nt，主要表達在發(fā)芽種子根伸長區(qū)的表皮組織中，且其轉錄水平受非生物脅迫的調控[23]。過表達BoNR8的株系表現出發(fā)芽率降低，主根變短，果莢發(fā)育不完整的表型。此外，BoNR8還可以調控甘藍對鹽脅迫及ABA 脅迫的敏感性[23]。這些成果說明了lncRNA 具有調控植物生長發(fā)育的功能。

2.2 LncRNA 調控植物的生殖發(fā)育

花粉發(fā)育是維持植物育性與產量的關鍵因素。1973 年，研究者鑒定出水稻光敏性雄性不育系“農墾58S”[24]，隨后的研究發(fā)現調控該株系育性的關鍵基因為一條水稻特異的lncRNALDMAR（long-day-specific male-fertility-associated RNA）[25]。LDMAR是一條長度為1236 nt 的lncRNA，在長日照條件下，水稻花粉正常發(fā)育需要LDMAR的充分表達。通過與可育的野生型“農墾58N”進行比較，發(fā)現“農墾58S”不育系中的LDMAR產生了一個從有C 到G 的單堿基突變，進而使得不育系中LDMAR的表達量顯著下降，最終“農墾58S”光敏雄性不育。LDMAR的單堿基突變可能改變了lncRNA的二級結構，從而影響了LDMAR的積累。此外，有研究發(fā)現“農墾58S”不育系中的siRNAPsi-LDMAR的表達豐度明顯提高，該siRNA 是由轉錄本AK111270產生的[26]。siRNAPsi-LDMAR是通過介導LDMAR啟動子區(qū)的甲基化抑制LDMAR的轉錄水平，最終引起“農墾58S”不育系的花藥絨氈層的細胞程序性死亡，造成其光敏雄性不育。

有研究在玉米成熟花粉的CDNA 文庫中利用差異篩選并結合冷菌斑篩選的方法克隆出一個在花粉里特異表達的lncRNAZm401（Zea mays 401）[27,28]。為研究Zm401在花粉發(fā)育中的作用，Zhao等[29]構建了玉米Zm401的過表達系，研究發(fā)現過表達系在生殖發(fā)育階段表現出玉米穗變小、花藥退化、花粉粒的數目和活性顯著降低等表型。之后的研究發(fā)現，在zm401缺失突變體中與花粉發(fā)育相關基因ZmMADS2、MZm3-3 和ZmC5的表達都發(fā)生明顯的改變，導致小孢子和絨氈層的發(fā)育異常，最終造成zm401突變體雄性不育[30]。將玉米中花粉特異的啟動子ZM13與Zm401的cDNA 連接構建成表達載體，并將其轉入煙草中異源表達，發(fā)現Zm401只在轉基因煙草的花粉中特異表達[31]。研究發(fā)現所有的Zm401轉基因煙草都表現出不同程度的不育現象，對花藥發(fā)育的深入分析發(fā)現，轉基因煙草的花藥發(fā)育后期出現異常，具體表現為絨氈層和結締組織降解滯后、內胚層細胞纖維帶沉積失敗、花粉粒發(fā)育中止等[31]。此外，Zm401在單子葉植物中具有高度的序列保守性以及穩(wěn)定的RNA二級結構表明Zm401可能在植物的花粉發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，可用于玉米雄性不育植株的培育。

Song JH,et al.[32]也在油菜中成功克隆出一個花粉特異表達的lncRNABcMF11，其長度為828bp且?guī)в衟oly(A)的尾。為研究BcMF11在花粉發(fā)育中的功能，Song JH,et al.[33]構建了BcMF11的反義RNA 株系，該株系中BcMF11的表達明顯下降。BcMF11表達的降低使得花粉萌發(fā)率下降、花粉管伸長延緩。進一步的細胞學觀察發(fā)現BcMF11的反義RNA 株系出現絨氈層降解滯后、小孢子分離及花粉粒發(fā)育異常等現象。這些結果說明BcMF11在油菜的花粉發(fā)育和雄性不育中發(fā)揮重要的作用。

3 LncRNA 發(fā)揮功能的分子機制

LncRNA 作為一類新的調節(jié)子參與植物的多個生物進程中，其調控機制十分復雜，可在轉錄、轉錄后、表觀遺傳等水平上調控蛋白編碼基因的表達進而影響植物的生長發(fā)育。

3.1 LncRNA 作為小RNA 的前體

作為一類新的調節(jié)子，lncRNA 可以被直接或間接的加工成更短的非編碼RNA 即小RNA 發(fā)揮作用。TAS（trans-acting-siRNA-producing locus）是反式作用小干擾RNA（tasiRNA）產生的前體，目前植物體內已鑒定出四個TAS成員，分別為TAS1、TAS2、TAS3和TAS4。tasiRNA 是植物體內一類特異的內源小RNA，研究表明其在植物的多個生物進程中都發(fā)揮重要的作用。TAS可在miRNA的作用下被剪切，剪切產物在RDR6（RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE6）和DCL4（DICERLIKE4）的作用下形成雙鏈的RNA 分子即tasiRNA[34-37]。AT3G17185（TAS3a）是TAS家族中的一個成員，其可在miR390 的作用下被剪切，然后經過一系列的加工，最終形成tasiRNAs。miR390的表達可被生長素IAA 誘導，進而促進了tasiRNAs 的產生，這些tasiRNAs 可以抑制生長素相關基因ARF2、ARF3及ARF4的表達，最終促進側根的生長，表明TAS3a可通過形成tasiRNAs 參與生長素誘導側根形成的過程[35]。

Ben AB,et al.[38]通過分析擬南芥全長cDNA 文庫，發(fā)現76 條新的npcRNA，通過與現有的小RNA數據庫進行序列比對，推測其中可能有9 條為miRNA、tasiRNA 或24nt siRNA 的前體。其中npc83是miR869a 的前體，并能在dcl4突變體中積累。此外，Boerner S,et al.[39]從玉米的一組全長cDNA文庫中鑒定得到的1802 條lncRNA，發(fā)現其中可能有60%的lncRNA 是miRNA 的前體序列。

3.2 LncRNA 作為miRNA 的模擬靶基因

小RNA miRNA 可以利用序列互補性結合至特異的mRNA 上，造成位點特異地剪切或抑制mRNA 的翻譯。偽靶基因”是指一類可與miRNA 相結合，進而抑制miRNA 的活性但又不被miRNA降解的內源非編碼RNA。研究發(fā)現，一些lncRNA 可以作為miRNA 的偽靶基因發(fā)揮功能。IPS1是擬南芥中一個表達受磷饑餓誘導的lncRNA，其部分序列可通過堿基互補配對至同樣受磷饑餓誘導的miR399 上，但由于包含一個不匹配環(huán)使得IPS1不能被miR399 切割。過表達IPS1可以妨礙miR399與其靶基因PHO2的結合，致使PHO2的積累量增加，導致地上部磷含量降低[40]。根據lncRNA 的這一功能特性，我們可以人工合成miRNA 的模擬靶標（target mimicry）用來控制該miRNA 的功能，達到預期目標。

3.3 LncRNA 參與蛋白的重定位

GmENOD40最初是在豆科植物中發(fā)現的一種根瘤素基因，其序列在多個物種間的保守性很高[41-43]。通過酵母三雜交篩選出與蒺藜苜蓿中的MtENOD40互作的一個新的RNA 結合蛋白MtRBP1（Medicago truncatulaRNA Binding Protein 1）。研究發(fā)現MtRBP1 定位在植物細胞的細胞核的核小點斑中，但當MtENOD40過表達后，MtRBP1 會重新定位于細胞質中。隨后的研究又發(fā)現了兩個小根瘤素酸性RNA 結合蛋白MtSNARP1（Medicago truncatulasmall nodulin acidic RNA-binding protein 1）和MtSNARP2 也可以與MtENOD40結合，且這兩個蛋白的定位都受到MtENOD40的調控[44]。這些研究說明MtENOD40可以通過與蛋白結合進而影響蛋白的定位，這是lncRNA 發(fā)揮功能的一種重要的作用機制。

3.4 LncRNA 參與mRNA 的可變剪切

可變剪切是調控基因表達的一種重要的方式。Bardou F,et al.[45]在擬南芥中鑒定出MtRBP1 的同源蛋白NSRa 和NSRb，這兩個蛋白也是定位于細胞核的核小點中。由于NSRa 和NSRb 與一些可變剪切體是共定位的，因此研究者重點研究了這兩個蛋白在可變剪切中的作用?？紤]到NSRa 和NSRb可以與lncRNA 結合，利用RNA 免疫沉淀（RIP）技術篩選并鑒定出1 個可以與這兩個蛋白結合的lncRNA SCO-lncRNA（Alternative Splicing Competitor lncRNA）。深入地研究發(fā)現ASCO-lncRNA 可以與mRNA 競爭性地結合NSR 蛋白，從而影響mRNA 的可變剪切。

3.5 LncRNA 參與染色質重塑

染色質重塑對動、植物發(fā)育過程中特異基因的表達具有重要的作用。LncRNA 可以通過介導染色質重塑調控相關基因的表達進而調節(jié)植物的生長發(fā)育。開花抑制基因FLC（FLOWERING LOCUS C）可以通過染色質修飾調節(jié)植物開花時間。春化作用是控制植物花期的重要機制，研究發(fā)現，冷處理可以誘導VIN3（Vernalization insensitive 3）的表達，VIN3 招募染色質重構復合物PRC2 至FLC基因上，增強了H3K27me3，進而抑制FLC的表達[46]。Swiezewski S,et al.[47]鑒定出兩個非編碼RNA，分別為正義lncRNACOLDAIR（Cold assisted intronic noncoding RNA）和反義lncRNACOOLAIR（Cold induced antisense intragenic RNA）。其中COOLAIR產生于FLC基因的3’端，含有5’帽子及3’poly（A）。冷處理誘導COOLAIR表達，導致FLC的轉錄被瞬時抑制，進一步冷處理誘導了VIN3的表達，VIN3通過招募PRC2 到FLC基因上增強H3K27me3 組蛋白修飾，沉默FLC 基因的表達，進而促進植物開花。有研究表明COOLAIR不是抑制FLC基因表達的必須ncRNA[49]。COLDAIR是自FLC的第一個內含子區(qū)轉錄而來，含有含有5’帽子但沒有3’poly（A）結構。COLDAIR的表達受冷處理的誘導，在處理20 d 后其誘導量達到峰值，處理30 d 后其表達恢復至處理前的水平。研究發(fā)現，COLDAIR缺失突變體在冷處理后表現出開花延遲的現象，說明COLDAIR可以調控植物的開花。進一步的研究發(fā)現COLDAIR可以與PRC2 復合體的重要組成成分CLF 相互作用[50]。因此，冷處理下，COLDAIR可能通過募集PRC2 到FLC染色質引起FLC的表觀沉默，抑制其表達，最終促進開花[48]。COLDAIR是植物中首次發(fā)現的參與基因染色質表觀遺傳學修飾的lncRNA[46]。此外，lncRNAAPOLO（AUXIN REGULATED PROMOTER LOOP）是由RNA 聚合酶II 和V 從距離PID（PINOID）基因上游約5 kb處轉錄而來。APOLO可以通過調控PID基因啟動子區(qū)的染色質環(huán)調節(jié)PID的表達，進而影響植物對生長素的響應[49]。

4 結語與展望

已有研究表明lncRNA 是一類重要的維持動、植物正常生長發(fā)育的調節(jié)子，這使得lncRNA 成為當前生物科學家研究的熱點。近年來，隨著高通量測序技術的進步和生物信息學手段的應用，越來越多的lncRNA 被鑒定出來，但由于lncRNA 調控機制的復雜多樣性，使得植物中l(wèi)ncRNA 功能及作用機理的研究還處于起步階段。lncRNA 研究中面臨許多亟待解決的問題，如一些lncRNA 中包含有非常短的開放閱讀框，對其功能是lncRNA 還是小肽在發(fā)揮作用還存在爭議；lncRNA 的構成單元是核苷酸，某些堿基的改變不影響其功能，使得其突變體構建成為實驗技術上的難點；lncRNA 可用數據庫少，信息不全面，加上多數lncRNA 在物種間的保守性低，增加了對新的lncRNA 研究工作的難度。因此需要建立更多更有效的方法、技術應用于lncRNA 的研究。相對于在人和動物中的研究，植物中l(wèi)ncRNA 的相關研究十分匱乏，我們可以借鑒動物中豐富的lncRNA 的信息及其成熟的研究手段和技術用于植物中l(wèi)ncRNA 的研究。綜上，隨著科技的快速發(fā)展，在不同的植物物種中篩選lncRNA已經不再困難。目前研究者的重點已轉移到解析lncRNA 的功能及其作用機制上來，相信未來會有越來越多的lncRNA 被深入研究，對拓寬lncRNA 的應用范圍具有重要的意義。