褚夢穎,劉廣純

遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 沈陽 110044

鎘(Cadmium，Cd)是嚴(yán)重危害人類健康的污染物，主要損傷腎臟、骨胳和呼吸系統(tǒng)[1]。具有較高的生物富集指數(shù)，并可以通過食物鏈危及人類健康[2,3]。鎘的存在及潛在危害引起人們的廣泛關(guān)注[4]。

鎘進(jìn)入昆蟲體內(nèi)引起一系列的生理生化反應(yīng)。鎘通過Ca2+通道穿過細(xì)胞膜進(jìn)入機(jī)體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基和活性氧（ROS），ROS 與體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜損傷，并影響多種酶活力，對生物體造成威脅[5]。家蠶五齡幼蟲隨著Cd2+處理濃度的升高，其脂肪體內(nèi)丙二醛(MDA)含量增加，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性呈現(xiàn)規(guī)律性變化[6]。果蠅隨著鎘處理濃度的升高，體內(nèi)MDA 的含量也隨之升高，SOD 與CAT活性降低[7]。棕尾別麻蠅在鎘的脅迫下，體內(nèi)的SOD、CAT 酶活力均受到極顯著影響[8]。鎘的毒性作用與其能夠誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生氧化損傷密切相關(guān)，并且氧化損傷相關(guān)指標(biāo)變化可以作為機(jī)體遭受鎘等重金屬脅迫的生物指示物[9,10]。

蛆癥異蚤蠅Megaselia scalaris是世界廣泛分布的腐食性蠅類，通過取食在體內(nèi)聚集各種腐敗物質(zhì)，包括各種污染物，是較理想的檢測污染物生物的實(shí)驗(yàn)動物[11,12]。我們前期研究表明，Cd2+對蛆癥異蚤蠅幼蟲生長、壽命、化蛹率及羽化率均有顯著抑制。但對其體內(nèi)生理生化過程的影響還未見報道。本研究通過測定在不同濃度Cd2+脅迫條件下，蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)的抗氧化酶活性及MDA 含量，研究其對昆蟲生理生化過程的影響。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

蛆癥異蚤蠅M.scalaris為2008 年采于沈陽，并在沈陽大學(xué)城市有害生物綜合治理與生態(tài)安全遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的種群。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用試劑，均購于國內(nèi)試劑公司（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)所用試劑Table 1 The reagent used in the experiment

1.3 飼養(yǎng)方法

蛆癥異蚤蠅幼蟲采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基飼養(yǎng)，具體配比見表2。以空白組培養(yǎng)基飼養(yǎng)的蛆癥異蚤蠅幼蟲為對照組，以Cd2+濃度為7.5 μg/g，15 μg/g，30 μg/g 和60 μg/g 培養(yǎng)基飼養(yǎng)的蛆癥異蚤蠅幼蟲為實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3 次重復(fù)。恒溫培養(yǎng)箱溫度24±1 ℃，相對濕度75%，光周期12 L:12 D。

表2 不同實(shí)驗(yàn)組蛆癥異蚤蠅幼蟲培養(yǎng)基成分配比Table 2 The composition of culture medium for the larvae of Megaselia scalaris in different experimental groups

1.4 酶液提取

將供試蛆癥異蚤蠅幼蟲按照1:9（m/v）比例與預(yù)冷生理鹽水（0.86%）混合加入到已滅菌的EP管中，冰浴條件下制備成10%的組織勻漿液，將其置于低溫離心機(jī)中4 ℃、6000 r/min 離心10 min，取上清液置于0 ℃冰浴待測。

1.5 MDA 含量和酶活力測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)比色法；MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法：SOD活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法；CAT 活性測定采用可見光法；GSH-PX 活性的測定采用5,5’-二硫代硝基苯甲酸（DTNB）顯色法。本實(shí)驗(yàn)樣品中MDA 和蛋白質(zhì)含量以及SOD、CAT 和GSH-PX 酶活性均采用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。具體操作按說明書進(jìn)行。

SOD 活性單位定義為1 mg 組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD 量為1 個活性單位。

CAT 活性單位定義為1 mg 組織蛋白1 s 分解1 μmol H2O2的量為1 個活性單位。

GSH-PX 活性單位定義為1 mg 組織蛋白1 min 扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH 濃度降低1 μmol/L 為1 個酶活力單位。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行One-way ANOVA 分析，Duncan 多重比較方法進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05 作為差異顯著性水平，P<0.01 作為差異極顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+脅迫對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)MDA 含量的影響

如圖1 所示，在空白組（0 μg/g）下，隨著時間的增加，MDA 含量具有一直上升的趨勢，蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)MDA 含量通常為3.058～3.988 nmol/mg protein。當(dāng)開始取食Cd2+后，無論是同一時間下，隨著處理濃度的升高，還是相同濃度下，隨著處理時間的增加，蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)的MDA含量均是上升趨勢，上升了46.763～112.663%。其中在Cd2+處理濃度為60 μg/g，處理時間為5 d 時，MDA 含量升到最高為8.481 nmol/mg protein。在Cd2+處理濃度為7.5 μg/g，處理前期（1～2 d），幼蟲體內(nèi)MDA 含量與對照組無顯著性差異（P>0.05），其余的處理濃度在各個處理時間測得體內(nèi)的MDA 含量均與對照呈極顯著性差異（P<0.01）。

2.2 Cd2+脅迫對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)SOD 酶活性的影響

從圖2 中觀察發(fā)現(xiàn)，較低Cd2+處理濃度下（7.5 μg/g，15 μg/g，30 μg/g），隨著處理時間的增加，體內(nèi)SOD 酶活性的促進(jìn)作用均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，均在處理時間3 d 時活力最強(qiáng)，分別對應(yīng)的酶活性值為82.555 nmol/mg protein，103.610 nmol/mg protein 和88.552 nmol/mg protein，而在高Cd2+處理濃度（60 μg/g）的處理前期（1～2 d），對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)的SOD 酶活性起促進(jìn)作用，并且在處理時間1 d 時達(dá)到最大，酶活性為81.880 nmol/mg protein，較對照組差異極顯著（P<0.01），處理后期（3～5 d）對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)的SOD 酶活性起抑制作用，并且在處理時間5 d 時，降到最低，酶活性為64.239 nmol/mg protein，較對照組差異極顯著（P<0.01）。

圖1 Cd2+對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)MDA 含量的影響Fig.1 Effect of Cd2+on MDA content in the larvare of Megaselia scalaris(Loew)

圖2 Cd2+對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)SOD 酶活性的影響Fig.2 Effect of Cd2+on SOD activity in the larvare of Megaselia scalaris(Loew)

2.3 Cd2+脅迫對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)CAT 酶活性的影響

由圖3 可以看出，不論同一處理時間下隨著Cd2+處理濃度的升高，還是相同的Cd2+處理濃度下隨著處理時間的增加，蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)的CAT 酶活性均是先升后降的趨勢，在較低Cd2+處理濃度（7.5 μg/g，15 μg/g，30 μg/g）下，對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)CAT 酶活性的影響與SOD 酶活性的影響大體相同，即均起到了促進(jìn)作用，但不同的是在Cd2+處理濃度為60 μg/g，處理時間為5 d 時，對其CAT 酶活性起到了抑制作用，酶活性降至最低為6.561 nmol/mg protein，較對照組差異顯著（P<0.05）。在較低Cd2+處理濃度（7.5 μg/g，15 μg/g，30 μg/g）下，蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)CAT 酶活性均在處理時間為3 d 時達(dá)到最大值，分別對應(yīng)的CAT 酶活性值為8.933 nmol/mg protein，10.655 nmol/mg protein，9.667 nmol/mg protein，均較對照組差異顯著（P<0.05），在高Cd2+處理濃度（60 μg/g）下，則在處理時間為4 d 時，CAT 酶活性達(dá)到最高，為8.840 nmol/mg protein，較對照組差異顯著（P<0.05）。

圖3 Cd2+對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)CAT 酶活性的影響Fig.3 Effect of Cd2+on CAT activity in the larvare of Megaselia scalaris(Loew)

圖4 Cd2+對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性的影響Fig.4 Effect of Cd2+on GSH-PXactivity in the larvare of Megaselia scalaris(Loew)

2.4 Cd2+脅迫對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性的影響

如圖4 所示，在處理前期（1～2 d），較低Cd2+處理濃度（7.5 μg/g，15 μg/g）下，對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性起到顯著促進(jìn)作用，在處理后期（3～5 d），對幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性起到抑制作用，并且觀察得到在Cd2+濃度為7.5 μg/g 時，隨著處理時間的增加，幼蟲體內(nèi)GSH-PX酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在Cd2+處理濃度為15 μg/g，處理時間為1 d 時，幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性達(dá)到最高，為403.115 nmol/mg protein，較對照組差異極顯著（P<0.01），在處理時間為3 d 時，GSH-PX 酶活性呈現(xiàn)極速下降趨勢，下降了35.210～61.257%，隨著處理時間的增加（4～5 d），幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性依舊呈現(xiàn)下降的趨勢，但較為緩和。在高Cd2+處理濃度（30 μg/g，60 μg/g）下，不論是同一時間下隨著處理濃度的升高，或是相同處理濃度下隨著處理時間的增加，對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性均起到抑制作用，并且酶活性迅速下降，在Cd2+處理濃度為60 μg/g，處理時間為5 d 時，幼蟲體內(nèi)GSH-PX 酶活性達(dá)到最低，為80.803 nmol/mg protein，較對照組差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

鎘通過食物鏈可在昆蟲體內(nèi)積累[13-17]，并對昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生一系列影響[18-20]。其對昆蟲的主要毒性作用之一是產(chǎn)生氧化應(yīng)激，即細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[21,22]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)活性氧引起的細(xì)胞損傷。另一方面，昆蟲體內(nèi)SOD、CAT、GSH-PX 等酶系可以清除由于氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧[23-26]。這些酶的活性隨著活性氧數(shù)量的變化而有所差異[21,27-30]。

MDA 是細(xì)胞間發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量直接反映產(chǎn)生的自由基[31-34]。本研究顯示，隨著Cd2+處理濃度的升高和處理時間的增加，蛆癥異蚤蠅MDA 含量持續(xù)升高（圖1），呈現(xiàn)一定的濃度依賴和時間依賴效應(yīng)關(guān)系。表明蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度不斷增加，尤其在3 種抗氧化酶受到抑制而活性降低時，體內(nèi)大量ROS 無法及時清除，導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)細(xì)胞膜損傷。這與其他的學(xué)者研究結(jié)果一致[9,35]。

CAT 與GSH-PX 作為過氧化氫清除酶，進(jìn)一步催化由SOD 歧化反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2為無毒的H2O和，以防止機(jī)體受到損傷，其活性受H2O2濃度的直接調(diào)控[45]。不同Cd2+處理濃度對蛆癥異蚤蠅幼蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的CAT 活性(圖3)與GSH-PX 活性（圖4）表明，CAT 與SOD 具有相同的變化趨勢。在較低Cd2+處理濃度（7.5 μg/g）的處理前期（1～2 d），GSH-PX 活性明顯高于CAT，表明GSH-PX 更為靈敏，相對更早發(fā)揮消除H2O2作用。隨著處理時間的增加及Cd2+處理濃度的升高，GSH-PX 無法及時清除機(jī)體內(nèi)含量升高的H2O2，其活性受到抑制。而CAT 酶活性也有低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象，但變化比較平穩(wěn)，在一定程度上與GSH-PX 有互補(bǔ)作用。這種呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的變化趨勢與Cd2+對背角無齒蚌氧化損傷效應(yīng)評估的研究結(jié)果類似[46]。