陳其桂，李大文*，譚衛(wèi)紅，成俊萍，薛林濤，李金燕，何泳志，龐太森，韋福，黃泰帥

(1.廣西醫(yī)科大學，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學與遺傳中心，南寧 530021；3.桂林醫(yī)學院，桂林 541004；4.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖中心，南寧 530003)

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，大部分生殖中心的受精率約70～80%[1]。在某些情況下，低受精或受精完全失敗可能與促排卵刺激方案、女性體內(nèi)激素水平相關。另一方面，精卵相互作用異常也是其緣由之一[2]。研究指出，發(fā)生IVF完全受精失敗的概率約3%～5%[3]，受精失敗會給患者帶來情感與經(jīng)濟的雙重打擊。補救卵胞漿內(nèi)單精子注射術(R-ICSI)是在常規(guī)IVF-ET失敗后避免周期取消而實施的助孕技術，由Nagy等[4]在1993年提出并實施，使無數(shù)患者受孕。盡管目前補救ICSI取得了不錯的成績，但仍存在諸多問題，如助孕技術難題未完全解決、受精率及臨床妊娠率低下等[5]。且對補救ICSI妊娠結局的影響因素也沒有一致的研究，本研究依據(jù)妊娠狀況將補救ICSI患者分為妊娠組及未妊娠組，對精子正常形態(tài)率、頂體完整率及頂體反應率與補救ICSI結局相關性進行分析，進而優(yōu)化治療方案，給實施補救ICSI助孕技術前確立可靠的預測指標，以期提高臨床妊娠率。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2018年12月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學與遺傳中心行常規(guī)IVF-ET失敗而進行補救ICSI治療的125對不孕夫婦臨床資料，男方平均年齡(34.42±5.22)歲，女方平均年齡(31.90±3.31)歲。

納入標準：(1)女方年齡<38歲；(2)第一次新鮮胚胎移植周期；(3)女方彩超檢查提示卵巢功能無異常；(4)夫婦雙方無性傳播疾病、無遺傳性疾病史；(5)夫婦雙方染色體無異常；(6)使用控制性超排卵長方案。

排除標準：(1)男方服用影響精子生成及精子活力的藥物；(2)男方先天畸形、睪丸萎縮(包括附睪)、生殖系統(tǒng)感染；(3)女方子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等因素。

根據(jù)臨床妊娠結局將125對夫婦分為兩組：妊娠組(n=56)和未妊娠組(n=69)。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用GnRH激動劑(達菲林，益普生，法國)/FSH(果納芬，雪蘭諾，瑞士)和(或)人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，珠海麗珠醫(yī)藥)/HCG(雪蘭諾，瑞士) 長方案促排卵。從用促性腺激素(Gn)4 d后開始B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，當有2個卵泡直徑大于18 mm時，當晚9：00左右予HCG 10 000 U肌肉注射，36 h后取卵。

2.精液采集：男性患者禁欲2～7 d，手淫法取精液置于干燥消毒量杯內(nèi)，標本被轉(zhuǎn)送到實驗室過程中，保持在20～37℃，置于37℃恒溫箱內(nèi)液化。

3.精液常規(guī)檢測：IVF失敗前進行。通過稱重收集量器中的精液來測量精液體積；使用計算機精子輔助分析(CASA)系統(tǒng)測定精子密度、活力及各項參考值。參考《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第 5 版，精液體積參考值為≥1.5 ml；精子濃度≥15×106/ml或一次射精總數(shù)≥39×106/ml；前向運動精子(PR)≥32%。

4.精子正常形態(tài)率判定：IVF失敗前進行。本中心采用WHO推薦的Diff-Quik快速染色方法(Microptic，西班牙)精液涂片進行染色。只有精子頭、頸、中段和尾部均正常的精子才認為是正常精子。至少計數(shù) 200個精子，確定正常精子的形態(tài)率。

5.精子頂體完整率及頂體反應率判定：在IVF失敗前進行。按照Sigma公司的試劑盒操作說明書進行。采用密度梯度離心法+上游法處理液化好的精液，取10 μl精子懸液均勻涂抹在干凈的載玻片上，自然干燥后置于95%乙醇中固定30 min，再次干燥完畢后置于PSA工作液中，4℃避光反應8～12 h，反應結束后取出玻片，用去離子水輕微沖洗、干燥并避光保存，熒光顯微鏡450～490 nm激發(fā)光下油鏡觀察涂片。利用血細胞計數(shù)器計數(shù)400條以上精子，統(tǒng)計頂體完整精子數(shù)、頂體不完整精子數(shù)以及自發(fā)頂體發(fā)生數(shù)。頂體完整率=頂體完整精子總數(shù)/檢測精子總數(shù)×100%，自發(fā)頂體發(fā)生率=自發(fā)頂體發(fā)生數(shù)/檢測精子總數(shù)×100%。

6.補救ICSI適應癥及治療：以第二極體作為早期受精的判斷標準，受精6 h觀察，若患者所有成熟卵母細胞中出現(xiàn)明確第二極體的比例<30%，建議行補救ICSI。對未排出第二極體的卵母細胞于受精6～8 h后再次觀察，如仍未排出第二極體，于當晚行補救ICSI治療方案。

7.受精、卵裂及胚胎移植：常規(guī)行補救ICSI，治療后第1天觀察卵母細胞受精情況，以雙原核(2PN)卵母細胞作為正常受精卵。第3天按照Peter分級標準選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，移植胚胎數(shù)≤3個，剩余Ⅲ級以上胚胎予冷凍保存，并給予黃體支持。

8.妊娠判定及隨訪：移植術后第14天測血β-HCG水平，β-HCG>10 U/L為陽性。移植后第28天和第42天B超檢查了解胚胎發(fā)育情況，若B超見宮腔內(nèi)孕囊及心管博動則確立為宮內(nèi)妊娠；黃體支持自妊娠8周起逐漸減量至妊娠10周停用。隨訪至妊娠12周轉(zhuǎn)入產(chǎn)科門診建檔立卡及定期產(chǎn)檢。我科進行電話隨訪直至胎兒出生并記錄。

9.觀察指標：受精率=受精卵母細胞數(shù)/卵母細胞數(shù)×100%；卵裂率=卵裂數(shù)/受精卵母細胞數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期例數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活嬰分娩數(shù)/移植周期例數(shù)×100%；單胎率=單胎例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；雙胎率=雙胎例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、患者一般情況比較

兩組患者不孕年限、男方年齡、女方年齡、基礎FSH值及竇卵泡數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[M(min，max)]

二、兩組患者的精液質(zhì)量比較

統(tǒng)計結果顯示，兩組患者的精液量、精子濃度、精子總數(shù)、前向運動精子百分率、精子正常形態(tài)率、精子頂體完整率及精子頂體反應率上均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、促排卵及胚胎移植情況比較

兩組患者HCG日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、補救ICSI受精率、卵裂率、優(yōu)胚率均無顯著差異(P>0.05)，但妊娠組的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著高于未妊娠組(P<0.05)(表3)。

表2 兩組患者的精液相關參數(shù)[(-±s)，M(min，max)]

表3 促排卵及補救ICSI治療相關參數(shù)比較[M(min，max)]

四、精子正常形態(tài)率、頂體完整率及頂體反應率與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率相關性分析

Spearman等級相關分析結果顯示，精子正常形態(tài)率與受精率、卵裂率存在顯著相關性(P<0.05)，與優(yōu)胚率無顯著相關性(P>0.05)；精子頂體完整率與優(yōu)胚率存在顯著相關性(P<0.05)，與受精率、卵裂率均無顯著相關性(P>0.05)；精子頂體反應率與受精率、卵裂率及優(yōu)胚率均無顯著相關性(P>0.05)(表4)。

表4 Spearman等級相關分析

五、補救ICSI周期的妊娠結局情況

在125個補救ICSI周期中，臨床妊娠56例，臨床妊娠率為44.80%(56/125)；活產(chǎn)分娩數(shù)49例，活產(chǎn)率為39.20%(49/125)，其中單胎31例，單胎率為55.36%，雙胎18例，雙胎率為32.14%；早產(chǎn)11例，早產(chǎn)率為19.64%(11/46)；流產(chǎn)6例，流產(chǎn)率為10.71%(6/56)；異位妊娠1例。妊娠結局較好。

討 論

補救ICSI從提出發(fā)展到如今，已被廣泛應用，并獲得不錯的妊娠結局，早期補救ICSI可作為常規(guī)IVF失敗時的一種安全有效的補救方法[6]。同時，早期補救ICSI相較于晚期補救ICSI的胚胎發(fā)育和臨床結局更佳，更值得推薦，可作為IVF受精失敗或受精率不高者有效挽救計劃[7]。本研究發(fā)現(xiàn)補救ICSI周期妊娠組的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著高于未妊娠組，提示優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)多有利于補救ICSI周期臨床妊娠。這可能是由于當獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目充分時，具有良好發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎多，胚胎實驗室專家優(yōu)中選優(yōu)，進而挑選質(zhì)量更好的胚胎進行移植，降低了妊娠失敗率。

男性的生育力可通過精子形態(tài)這一重要指標來得到反映[8]，已有研究報道輔助生殖技術對于畸形精子癥患者具有顯著療效，可獲得較高的臨床妊娠率[9]。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，精子畸形是導致常規(guī)IVF失敗的重要緣由，精子正常形態(tài)率<4%可顯著增加受精失敗率。另有研究指出在IVF周期中正常受精與精子形態(tài)異常沒有相關性，但畸形精子癥患者組臨床妊娠率較正常組患者降低[11]。劉闖等[12]探討了精子正常形態(tài)率與IVF周期D3優(yōu)胚的囊胚形成率與囊胚質(zhì)量的相關性，結果發(fā)現(xiàn)精子正常形態(tài)率與優(yōu)質(zhì)囊胚形成率呈正相關，但并不影響總體囊胚形成。Younes等[13]研究指出，當精子正常形態(tài)率<4%，應優(yōu)先選擇ICSI作為一線治療方案，因為在此情況下ICSI周期在受精率、卵裂率、胚胎質(zhì)量及囊胚質(zhì)量等方面均優(yōu)于IVF周期。Li等[14]探討了精子形態(tài)對補救ICSI周期臨床結局的影響，結果發(fā)現(xiàn)妊娠組與非妊娠組患者在受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可移植胚胎率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率等方面均無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)在補救ICSI周期中，妊娠組與未妊娠組患者精子正常形態(tài)率無顯著差異，但精子正常形態(tài)率與受精率呈正相關，與卵裂率呈負相關。表明隨著精子正常形態(tài)率增加，受精胚胎數(shù)目增加，受精率升高，而卵裂率下降。這可能是由于當精子形態(tài)正常時，尤其是頭部形態(tài)正常，其頂體更為完整，頂體酶活性更佳，精子核DNA完好，精子整體質(zhì)量及精子活力更好，前向運動力更強，同時卵子激活過程與精子頂體反應密切相關[15]，這更有助于精卵之間的相互結合，推動受精過程的發(fā)生，受精率得以提高。一般來說，卵裂率隨著精子正常形態(tài)率增加而增加，但在我們的研究中發(fā)現(xiàn)精子正常形態(tài)率與卵裂率呈負相關，這可能因為在補救ICSI中，卵裂率受到其他多種不穩(wěn)定因素的影響更大，如精子DNA損傷、染色體異常、活性氧水平[16]、生殖系統(tǒng)炎癥、男性不良生活習慣及環(huán)境污染等，同時操作過程中技術人員不熟練也會形成干擾。具體原因尚不明確，仍需進一步研究討論。

精子頂體的完整性是體外受精助孕成功的關鍵之一。頂體結構不完整容易導致頂體反應發(fā)生障礙，影響受精，甚至導致男性不育。精子功能可通過精子頂體完整率體現(xiàn)，與IVF受精率有相關性[17]。頂體不完整性通常包括頂體缺乏、頂體薄、體積小、囊泡頂體及無內(nèi)容物等。孟祥黔等[18]研究指出空泡精子對ICSI患者胚胎發(fā)育及臨床結局無明顯影響，但由于樣本量不足結論并不確切。另外精子頂體有多種異常形態(tài)，臨床較為常見的為圓頭精子，異常形態(tài)的頂體結構常出現(xiàn)頂體和核膜分離，雙層膜結構部分消失，頂體反轉(zhuǎn)和核分離現(xiàn)象。Zahiri等[19]對其與體外受精結局的相關性做了研究，發(fā)現(xiàn)精子不同頂體形態(tài)(大、小、無頂體)可能與染色質(zhì)完整性呈負相關，可使精子的生育潛能下降，導致受孕率降低。何泳志等[20]發(fā)現(xiàn)在補救ICSI周期中，未妊娠組頂體完整率較妊娠組低，提示如果精子頂體更為完整時，可獲得更好的妊娠結局，但與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率相關性并不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)補救ICSI周期中妊娠組與未妊娠組患者間精子頂體完整率無顯著性差異，但是精子頂體完整率與補救ICSI優(yōu)胚率呈正相關。這可能是由于在受精過程中，發(fā)生頂體反應的前提要求是保持頂體完整性，頂體反應釋放了頂體內(nèi)容物中的大量水解酶并激活了精卵細胞相互融合的功能，是受精的前提和保證。頂體內(nèi)含有多種水解酶(如透明質(zhì)酸酶、頂體蛋白酶等)，與受精密切相關，影響精子與卵母細胞融合，對于體外受精結局的影響是至關重要的[21]。當精子頂體缺損時，臨床結局就會不理想。

精子頂體反應是膜融合、水解酶及基質(zhì)蛋白釋放的生理分泌過程，它使精子能夠穿透卵母細胞。不穩(wěn)定的頂體狀態(tài)、頂體反應不足或頂體酶活性不足都可能損害精子的受精能力。頂體反應包括激活受體、膜結合、酶釋放以及透明帶水解等復雜過程，由鈣離子調(diào)節(jié)。有研究指出當精子自發(fā)頂體反應率≥9.52%或精子自發(fā)頂體反應率≥9.52%及頂體酶活性<25 μIU/106時，應優(yōu)先倡議行早期補救ICSI或直接行ICSI助孕[22]，可得到更好的臨床妊娠結局。肖鑫等[23]探討精液質(zhì)量對IVF與補救ICSI周期結局的影響，發(fā)現(xiàn)當頂體反應率<15.7%時，補救ICSI助孕技術可降低受精失敗率。本研究中兩組患者的精子頂體反應率無顯著差異，且與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率亦無相關性。這可能是由于精子頂體在受精前因某些因素影響而誘發(fā)了自身頂體反應，或者本研究樣本量納入不足導致差異無顯著統(tǒng)計學意義，具體原因有待進一步探討。

本研究納入的125個補救ICSI周期中，臨床妊娠56例，活產(chǎn)分娩數(shù)49例，單胎31例，雙胎18例；早產(chǎn)11例，流產(chǎn)6例，異位妊娠1例。結果初步表明補救ICSI是IVF受精失敗后不錯的選擇方案，它可以避免周期取消，給患者提供了再次妊娠的機會，且早期補救ICSI方案更值得推薦應用[24]。但是，目前關于精子正常形態(tài)率、頂體完整率及頂體反應率與補救ICSI結局相關性研究尚不足，以后研究中需將更多臨床數(shù)據(jù)納入研究分析，方可得出更為確切的結論。