佘 軍 高迎春 來漢江 王 賢 饒煥新 賀君麗 孫 剛 周艷瓊▲

1.杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院臨床微生物科，浙江杭州 311200；2.杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310053

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病，以肺部感染最為常見，是僅次于艾滋病所引發(fā)的第二大致死傳染病，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2019年全球結(jié)核病報(bào)告，2018年約有1000萬結(jié)核新發(fā)病例。WHO將結(jié)核病作為重點(diǎn)控制的傳染病之一。我國高度重視肺結(jié)核的預(yù)防和控制。為進(jìn)一步提高結(jié)核病的病原學(xué)診斷率，“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃要求，我國東中部地區(qū)和西部地區(qū)分別有80%和70%的縣（市、區(qū)）應(yīng)具備開展結(jié)核病分子生物學(xué)診斷的能力[2]。而痰液的病原學(xué)檢查，如涂片鏡檢、痰液培養(yǎng)、核酸檢測等方法，是輔助結(jié)核病診斷的重要手段[3]?？紤]到許多區(qū)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室的人力資源有限，樣本量較少，可能采取連續(xù)幾天存樣，再集中檢測的工作模式。根據(jù)國衛(wèi)辦疾控函〔2016〕672號(hào)和中疾控疾控便函〔2017〕80號(hào)通知，我國對(duì)結(jié)核病試行分級(jí)診療模式，痰液樣本或需要運(yùn)送至上級(jí)醫(yī)院（如地市級(jí)、省級(jí)醫(yī)院或疾病控制中心）進(jìn)行菌種鑒定、藥敏試驗(yàn)等檢驗(yàn)。在痰結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)過程中，對(duì)陽性率的影響因素眾多，如痰液采集方法、時(shí)機(jī)、痰液性狀及質(zhì)量、轉(zhuǎn)運(yùn)等[4-14]。如何保證樣本在儲(chǔ)存或運(yùn)輸后不會(huì)影響后續(xù)分子診斷結(jié)果，成為迫切需要研究的問題。

本研究旨在探討痰樣本保存條件和保存時(shí)間對(duì)痰液樣本中核酸檢測結(jié)果的影響。尋找妥善的痰液保存方式以保證核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為基層實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)診斷工作的開展提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

痰液樣本來自杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院臨床微生物科室在2018年11月～2019年1月日常檢驗(yàn)的剩余樣本104例。

1.2 樣本篩選

選取痰液樣本體積不少于1.5mL。

1.3 樣本分裝

將每份痰液分別分裝為2～3等份，每份0.5mL，保存于2mL凍存管中。

1.4 保存條件及檢測組別設(shè)置

（1）室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)。將痰液樣本和溫度記錄儀（深圳市華圖測控系統(tǒng)有限公司）存放于室溫環(huán)境下，以試驗(yàn)開始記為第0天。分別在第0天、第5天和第8天，記錄痰液核酸的檢測結(jié)果。（2）冷藏穩(wěn)定性試驗(yàn)。將痰液樣本和溫濕度記錄儀一起存放于冰箱冷藏室內(nèi)，以試驗(yàn)開始記為第0天。分別在第0天、第5天和第8天，記錄痰液的核檢測結(jié)果。（3）冷凍穩(wěn)定性試驗(yàn)。將痰液樣本和溫濕度記錄儀存放于冰箱冷凍室內(nèi)，以試驗(yàn)開始當(dāng)天記為第0天。分別于第0天、第1個(gè)月和第3個(gè)月，對(duì)痰液進(jìn)行核酸檢測，記錄檢測結(jié)果。（4）凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)。將痰液樣本存放于冰箱冷凍室內(nèi)，以試驗(yàn)開始當(dāng)天記為第0天。從第1天起，每天將痰液樣本從冰箱中取出，解凍1h至室溫后，再放回冰箱冷凍。分別于第0天和第4次凍融后，對(duì)痰液進(jìn)行核酸檢測，記錄檢測結(jié)果。

1.5 核酸檢測

依據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行痰液樣本的液化處理[4]。使用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法）（MTC2.0試劑盒，國械注準(zhǔn)20193401027）以及配套的全自動(dòng)醫(yī)用恒溫?cái)U(kuò)增熒光分析儀（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司），按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行痰液樣本的核酸檢測。記錄檢測結(jié)果（陰性或陽性）和擴(kuò)增曲線的Tt值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示。對(duì)比同一保存條件下不同時(shí)間點(diǎn)的Tt值差異采用單因素ANOVA分析。兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)

本研究記錄的室溫范圍為14～22℃。對(duì)室溫（14～22℃）存放5d和8d的痰液樣本進(jìn)行核酸檢測，檢測結(jié)果見圖1，室溫第0天檢測結(jié)果為8例陽性、18例陰性。室溫存放第5天和第8天后再次檢測，均與室溫0d檢測結(jié)果一致，未發(fā)生陽性樣本漏檢的情況。見表1。

表1 室溫放置不同時(shí)間對(duì)痰液樣本檢出率的影響

樣本在室溫存放第0天、第5天和第8天，擴(kuò)增速率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.425）。見圖1，表2。

圖1 室溫存放樣本對(duì)核酸檢測速率的影響

2.2 冷藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

本研究記錄的冷藏溫度為4～8℃。如表3所示，0d檢測結(jié)果為11例陽性、15例陰性。冷藏5d和8d后再次檢測，均為11例陽性和15例陰性，與0d檢測結(jié)果一致，未發(fā)生陽性樣本漏檢的現(xiàn)象。

表2 室溫放置不同時(shí)間對(duì)樣本擴(kuò)增速率的影響（±s）

表2 室溫放置不同時(shí)間對(duì)樣本擴(kuò)增速率的影響（±s）

時(shí)間 n 樣本擴(kuò)增速率 F P室溫第0天 8 16.24±4.50 0.891 0.425室溫第5天 8 16.28±5.80室溫第8天 8 20.03±8.58

表3 冷藏條件下放置不同時(shí)間對(duì)痰液樣本檢出率的影響

但是，MTC2.0試劑盒的核酸擴(kuò)增速率（Tt值）同樣出現(xiàn)逐漸變大的現(xiàn)象（圖2）。樣本在冷藏條件下存放第0、5和8天，擴(kuò)增速率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.066）。見表4。

圖2 冷藏保存樣本對(duì)核酸檢出速率的影響

表4 冷藏保存樣本不同時(shí)長對(duì)擴(kuò)增速率的影響（±s）

表4 冷藏保存樣本不同時(shí)長對(duì)擴(kuò)增速率的影響（±s）

時(shí)間 n 樣本擴(kuò)增速率 F P冷藏第0天 11 11.08±4.01 2.973 0.066冷藏第5天 11 12.19±4.61冷藏第8天 11 15.10±3.26

2.3 冷凍穩(wěn)定性試驗(yàn)

本研究記錄的冷凍溫度在-18～-23℃之間循環(huán)變化。對(duì)冷凍第1個(gè)月和第3個(gè)月的痰液樣本進(jìn)行再次檢驗(yàn)，如表5所示，結(jié)果與冷凍0d檢測結(jié)果一致，樣本均為9例陽性、17例陰性，未發(fā)生錯(cuò)檢現(xiàn)象。

表5 冷凍條件下放置不同時(shí)間對(duì)痰液樣本檢出率的影響

通過分析陽性樣本的擴(kuò)增速率（Tt值）可見，與對(duì)照組冷凍0d的擴(kuò)增Tt值相比，痰液樣本冷凍第1個(gè)月和冷凍第3個(gè)月后，擴(kuò)增曲線的Tt值已顯著延緩（圖3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

圖3 冷凍保存樣本對(duì)核酸檢測速率的影響

表6 冷凍存放樣本不同時(shí)長對(duì)擴(kuò)增速率的影響（±s）

表6 冷凍存放樣本不同時(shí)長對(duì)擴(kuò)增速率的影響（±s）

時(shí)間 n 樣本擴(kuò)增速率 F P冷凍第0天 9 10.50±2.01 4.895 0.016冷凍第1個(gè)月 9 13.20±2.57冷凍第3個(gè)月 9 17.47±7.57

2.4 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)方法，將樣本進(jìn)行反復(fù)凍融4次，其檢測結(jié)果與凍融0次的一致，9例陽性、17例陰性，見表7，未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)檢現(xiàn)象。

表7 凍融次數(shù)對(duì)痰液樣本核酸檢出率的影響

分析Tt值可知，凍融4次后，痰液樣本核酸檢測速率與凍融第0次無顯著延遲（圖4），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.986）。見表8。

圖4 凍融樣本對(duì)核酸檢測速率的影響

表8 凍融次數(shù)對(duì)擴(kuò)增速率的影響（±s）

表8 凍融次數(shù)對(duì)擴(kuò)增速率的影響（±s）

次數(shù) n 樣本擴(kuò)增速率 t P凍融第0次 9 13.67±5.11 0.018 0.986凍融第4次 9 13.68±5.59

3 討論

有研究表明痰液保存條件對(duì)病原學(xué)檢查結(jié)果有影響，痰液長期存儲(chǔ)后會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)陽性率下降[10-14]。本研究從分子診斷的核酸檢測的角度探討了痰液樣本在保存過程中核酸檢測結(jié)果的變化，得到了與此前研究類似的結(jié)果。盡管未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)檢、漏檢樣本的現(xiàn)象，但核酸擴(kuò)增速率（Tt值）的延遲，充分說明了痰液核酸在不利條件下的保存過程中發(fā)生了降解。

盡管常溫存放5～8d，樣本核酸擴(kuò)增速率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但觀察8例陽性樣本的熒光擴(kuò)增速率，隨著室溫存放時(shí)間的延長，擴(kuò)增Tt值逐漸變大，即擴(kuò)增變慢的趨勢，甚至有1例樣本出現(xiàn)漏檢的風(fēng)險(xiǎn)（圖1）。而此前的研究顯示，痰液樣本存放需要14～28d，其培養(yǎng)陽性率才會(huì)顯著下降。這種差異的出現(xiàn)，可能原因有：（1）核酸擴(kuò)增試劑具有較高靈敏度，這使其能夠在更早的時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)痰液核酸的微量變化。（2）本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)隨著存放時(shí)間延長，核酸擴(kuò)增速率變慢，若繼續(xù)延長本研究的試驗(yàn)周期，核酸降解進(jìn)一步加劇，很可能也會(huì)出現(xiàn)漏檢結(jié)果。因此，本研究與之前的研究結(jié)果本質(zhì)上仍然是一致的，均表明痰液樣本不可存放過久。

冷藏保存研究的樣本中出現(xiàn)1例（圖2箭頭指示）在冷藏5d后核酸擴(kuò)增速率顯著延遲，而在冷藏8d后其擴(kuò)增速率變快而無顯著延遲的現(xiàn)象，考慮是對(duì)該樣本進(jìn)行分組時(shí)，取樣不均所致。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，樣本冷藏保存0、5和8d的擴(kuò)增速率差異不顯著。

本研究中室溫保存（14～22℃）5d與冷藏保存（4～8℃）5d，都未發(fā)現(xiàn)痰液核酸有顯著降解。其原因可能是，這兩種保存溫度都遠(yuǎn)低于大多數(shù)生物活性物質(zhì)的最佳溫度37℃。鑒于氣溫的晝夜變化和季節(jié)性波動(dòng)，室溫條件實(shí)在難以避免痰液中雜菌生長和核酸降解的加速，進(jìn)而影響后續(xù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，對(duì)比上述兩種保存條件，本研究建議優(yōu)先選擇冷藏保存痰液的方式。

此前有研究提示樣本反復(fù)凍融可使痰液中的微量菌種發(fā)生改變，從而影響核酸檢測結(jié)果[15]，但本研究中并未發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融對(duì)結(jié)核菌核酸檢測結(jié)果的影響。此差異的可能原因有：一方面，可能是因?yàn)榻Y(jié)核菌陽性患者的痰液中，結(jié)核菌載量較大，反復(fù)凍融造成的影響不顯著。另一方面，此前研究發(fā)現(xiàn)只有在反復(fù)凍融3次以上后，痰液中的微量菌種才會(huì)開始發(fā)生改變，而本研究中只做到了4次凍融測試，受凍融次數(shù)和樣本量的限制，本研究尚未觀察到凍融對(duì)核酸檢測結(jié)果有顯著影響。但對(duì)于大多數(shù)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，反復(fù)凍融4次已足夠滿足日常工作的需要。

值得注意的是，核酸檢測試劑無法鑒定結(jié)核菌活性。即使結(jié)核菌的生長活性受到樣本存放條件的影響，但只要基因組核酸沒有降解，核酸檢測的結(jié)果就不會(huì)改變。因此，本研究的結(jié)果不適用于樣本保存后的培養(yǎng)檢驗(yàn)。

綜上所述，本研究從結(jié)核檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際工作需求出發(fā)，探討了不同保存條件對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法）的痰液樣本核酸檢測結(jié)果的影響。在條件允許的情況下，痰液樣本應(yīng)盡量做到當(dāng)天檢測，以獲得最準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。如當(dāng)天無法檢測，痰液樣本應(yīng)保存在冷凍環(huán)境下，時(shí)間不超過1個(gè)月并避免反復(fù)凍融，或保存在冷藏條件下，時(shí)間不超過5d，以確保后續(xù)核酸檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。