何國榮

(黃山區(qū)動物疫病預防與控制中心，安徽 黃山 245700)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高度接觸性以急性腸炎及水樣腹瀉為主要特征的傳染病[1]。本病于1978年首次報道于比利時和英國，此后在歐洲和亞洲等多個國家相繼發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[2]。豬只感染豬流行性腹瀉通常發(fā)病突然，傳播速度較快，病程較長，臨床治療使用抗生素無效。該病發(fā)病率高，哺乳仔豬死亡率也很高。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員，基因組為線形單股正鏈長27～33 kb的RNA病毒[3]。M蛋白是一種跨膜蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用，同時也是病毒刺激機體產(chǎn)生免疫保護的重要結(jié)構(gòu)蛋白，其抗原表位在疫苗的研發(fā)和新型檢測方法的建立中具有極大的應(yīng)用前景[4]。2017年5月安徽巢湖某豬場暴發(fā)疑似豬流行性腹瀉，筆者以PEDVM基因片段為引物，采取反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)進行診斷，現(xiàn)將診斷結(jié)果報道如下，以期為該病的早期診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病料：取安徽巢湖某豬場一發(fā)病豬的淋巴組織。試劑：rTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/ RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集與研磨 2017年5月安徽巢湖某豬場暴發(fā)疫病，架子豬及成年豬表現(xiàn)為水樣腹瀉，死亡率不高，發(fā)病哺乳仔豬表現(xiàn)為伴有脫水的水樣腹瀉且死亡率達85%以上，初步判斷該豬場疫病為豬流行性腹瀉，收集病死的哺乳仔豬淋巴結(jié)經(jīng)處理后放在-80℃冰箱待用。

1.2.2 RNA的提取與RT-PCR 按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA。取10 μL提取的RNA于50 μL反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲取cDNA。反應(yīng)體系：DEPC 水10 μL，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μL，5×M-MLV Buffer 10 μL，dNTPs(10 mmol/L) 3 μL，Rnase Inhibitor 1μL，RNA 20 μL，隨機引物4 μL。于42℃水浴鍋中孵育1 h后于70℃作用15 min。獲取的cDNA保存于-80℃待用。

1.2.3 PEDVM基因的PCR擴增 對PEDVM基因進行PCR擴增，PCR體系：rTaq DNA聚合酶Mix 10 μL，PEDV cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，補加滅菌ddH2O至20 μL。擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 50 s，54℃ 1 min，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物根據(jù)天根生化科技有限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒步驟，回收與純化產(chǎn)物，送至上海擎科生物有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病豬的臨床癥狀

發(fā)病豬場母豬存欄300余頭，先有零星母豬表現(xiàn)出水樣腹瀉，后擴散至哺乳仔豬及育肥豬，初期仔豬出現(xiàn)體溫降低、水樣腹瀉、嘔吐、脫水、扎堆，隨著病程延長，食欲下降，消瘦，最后導致脫水和代謝紊亂衰竭而亡，發(fā)病仔豬死亡率達85%以上。育肥豬及母豬體溫正?；蛏缘?，抗生素治療無效，個別豬只急性發(fā)病死亡，死亡率低。

2.2 PEDV M基因的擴增與測序結(jié)果

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約689 bp左右特異性條帶，與PEDVM目的基因相符(圖1)。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對確認為PEDVM基因，確診該豬場發(fā)生豬流行性腹瀉。

3 結(jié)論與討論

PED的流行對世界養(yǎng)豬業(yè)影響較大，2010年冬季至2011年春季，我國部分規(guī)模化養(yǎng)豬場發(fā)生該病，且用抗生素治療均未取得明顯效果，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，豬流行性腹瀉病毒的發(fā)生率呈上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成的損失加大[5]。PEDV可引發(fā)仔豬腹瀉性疾病，生長發(fā)育嚴重受阻，存活率、飼料轉(zhuǎn)化率、日增重等降低，最后衰竭而死；成年豬的臨床癥狀表現(xiàn)不一，但普遍表現(xiàn)厭食，嚴重時出現(xiàn)腹瀉；泌乳母豬的臨床癥狀與仔豬較為相似，嚴重時泌乳停止，通過垂直途徑傳染仔豬，這也是造成仔豬死亡率高的另一個重要原因[6]。

通過RT-PCR方法對豬場疑似豬流行性腹瀉進行診斷，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約689 bp的特異性條帶，經(jīng)測序鑒定，確認為PEDVM基因，由此確定該豬場發(fā)生的疫病為豬流行性腹瀉。該方法具有特異、敏感、快速簡便等優(yōu)點，可有效地檢測出樣品中的PEDV病原。測序結(jié)果有利于增加對豬流行性腹瀉M基因進化情況的理解，為PED的早期診斷提供了有效的方法，并為安徽地區(qū)PEDV的分子流行病學調(diào)查奠定了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。