馬榮秀 張雅偉 戚后娟 石彩 黃占華

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

皮膚是人體最大的器官，是維持人體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要保障，在生活中，皮膚不可避免地會受到創(chuàng)傷，造成體液內水分、蛋白等的流失，細菌很容易在傷口處繁殖引起感染，因此，保護皮膚的健康完整是十分必要的。傷口處理的基本原則是清潔與保護創(chuàng)面，減少組織滲出液，防止細菌感染。為達到以上治療效果，傷口敷料應運而生[1-3]。理想的傷口敷料應具有如下功能：①避免水分和體液的過分散失；②一定的抗菌性能；③透濕、透氣，為創(chuàng)面提供濕潤的環(huán)境；④生物相容性好及可降解的特點；⑤減少換藥次數(shù)，減輕環(huán)保壓力[4-5]。傳統(tǒng)敷料如醫(yī)用繃帶和紗布等，都能不同程度地吸收滲出液，對創(chuàng)面愈合有一定保護作用。但是，這類敷料不能為傷口提供濕潤環(huán)境，被浸透后會失去保護功能，易引起細菌感染[6-7]。海綿類敷料是一種新型的醫(yī)用敷料，具有連通的微孔結構，透氣性能優(yōu)異，能夠吸收大量滲出液，為傷口提供潮濕環(huán)境[8]。聚乙烯醇是一種水溶性高分子聚合物，可生物降解，具有良好的生物相容性，在藥物緩釋及傷口敷料等醫(yī)學領域有廣泛的應用，而單純的聚乙烯醇吸水性差，限制了聚乙烯醇在醫(yī)用敷料方面的應用[9-10]。海藻酸鈉是一種天然可降解多糖，具有促進傷口愈合、保濕和吸濕等功能[11-12]。本研究以聚乙烯醇和海藻酸鈉為原料，利用簡單的溶液共混和凍干成型相結合的方法，制備具有高孔隙度的海藻酸鈉-聚乙烯醇復合海綿，同時，載入抗菌藥物，研制新型兼有創(chuàng)造微濕環(huán)境、抑制細菌生長、促進傷口愈合的理想傷口敷料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

傅里葉紅外分光光度計(iS10，美國Nicolet公司)；掃描電子顯微鏡(QUANTA200，荷蘭FEI公司)；X射線衍射儀(D/MAX2200型，日本理學株式會社)；冷凍干燥機(FD-1A-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；酶標儀(分子設備公司，型號：SpectraMax i3x)。

聚乙烯醇(PVA)，分析純(醇解度98%～99%，1799型)，上海阿拉丁工業(yè)公司；海藻酸鈉(SA)，分析純，上海麥克林生化公司；磷酸二氫鉀(KH2PO4)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，分析純，天津基準化學試劑有限公司；10%中性福爾馬林，AR，南昌雨露實驗器材有限公司；實驗小鼠：健康SPF級昆明小鼠，年齡為8周，雄性，體質量為200 g左右，由遼寧省動物資源中心提供。

1.2 SA-PVA復合海綿的制備

SA-PVA復合海綿的制備流程如圖1所示。首先制備質量分數(shù)10%的PVA溶液和2%的SA溶液。然后，將兩種溶液按比例混合，在40 ℃下攪拌3 h，得到SA-PVA混合液(SA的質量分別為總固體質量的0、10%、20%、40%)。將得到的SA-PVA混合溶液靜置2～3 h，以除去氣泡。最后，倒入模具中，在-20 ℃下冷凍20 h，室溫下解凍4 h，連續(xù)3個循環(huán)并冷凍干燥制備SA-PVA復合海綿。根據(jù)SA的質量分數(shù)，將復合海綿分別命名為PS0、PS1、PS2和PS4。通過浸漬的方式載入NFX，得到載藥型海綿敷料用于小鼠傷口愈合實驗。

1.3 SA-PVA復合海綿的結構表征

樣品的紅外光譜采用傅里葉紅外分光光度計(FT-IR)進行表征，ATR附件，掃描范圍為500～4 000 cm-1。樣品的形貌采用掃描電子顯微鏡(SEM)進行表征，在觀察之前把樣品粘在導電膠上，噴金處理。樣品的結晶度采用X-射線衍射儀(XRD)進行測試，掃描范圍5°<2θ<50°，掃描速度4°/min。

1.4 SA-PVA復合海綿的性能測試

溶脹性：將干燥的樣品制成直徑為2 cm的圓柱形，稱質量記為M0，浸入37 ℃的去離子水中。每間隔一定時間取出，用濾紙吸去殘留水，稱質量記為Mt。得到海綿的溶脹率[13]：

(1)

保水性：將干燥的樣品制成直徑為2 cm的圓柱形，稱質量記為W0，浸入37 ℃的去離子水中，待樣品完全溶脹后，放入37 ℃環(huán)境中。每間隔一定時間，取出稱質量記為Wt，采用以下公式計算樣品的保水性[13]：

(2)

降解性：將干燥的樣品稱質量記為M1，浸入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，置于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩，速度為200 r/min。第3天、第7天和第14天取出，將樣品冷凍干燥，稱質量記為M2。由以下公式計算樣品的降解性能[14]：

(3)

孔隙率：將樣品制成大小相近的圓柱形，稱質量，記為m1，測量直徑和厚度，計算體積(v)。之后，將樣品浸入無水乙醇中(ρ=0.789 3 g/cm3)至飽和，取出后，擦拭樣品表面的無水乙醇，稱質量，記為m2。孔隙率按以下公式計算[15]：

(4)

1.5 SA-PVA復合海綿的生物相容性

溶血性測試：首先，取新西蘭大白兔耳緣靜脈血，與檸檬酸鈉溶液按照V(大白兔耳緣靜脈血)∶V(檸檬酸鈉溶液)=9∶1混合，得到新鮮抗凝血。將待測樣品浸泡在10 mL 0.9%的生理鹽水中1 h后，向試管中加入7 mL生理鹽水和0.2 mL稀釋抗凝血，V(新鮮抗凝血)∶V(生理鹽水)=4∶5，實驗組中加入0.1 g海綿，以只加入生理鹽水和去離子水的試管分別作為陰性和陽性對照。將試管于37 ℃條件下放置1 h后，于2 500 r/min條件下離心5 min，取上清液，利用酶標儀測量其在545 nm處的吸光度值，計算樣品的溶血率[16]：

(5)

式中：ODs、OD(-)和OD(+)分別代表樣品、陰性對照和陽性對照組的吸光度值。

細胞毒性測試：利用CCK-8方法測定復合海綿對NIH 3T3細胞生長活性的影響。首先，制備海綿浸提液，將海綿通過紫外照射滅菌4 h，按照0.1 g加1 mL液體的比例向海綿中加入DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃條件下放置48 h，取上層浸提液備用。以添加海綿浸提液的組別為實驗組，以添加完全培養(yǎng)基的組別為陰性對照組，對NIH 3T3細胞進行培養(yǎng)。于24、48和72 h取出對應的細胞培養(yǎng)板，利用酶標儀測定其在480 nm處的吸光度值。細胞存活率按以下公式計算[17]：

(6)

式中：As和An分別代表陰性對照和樣品的吸光度值。

1.6 動物實驗

在這項實驗中，使用體質量200 g左右的昆明小鼠模擬傷口愈合過程。取若干只小鼠，隨機分成3組，分別設為紗布對照組、PS2組和PS2-NFX組。術前將小鼠放置在麻醉罐中通過浸有乙醚的棉花麻醉，進行剃毛及消毒處理，使用手術剪使小鼠背部形成直徑約為7 mm的傷口。將相應的樣品附著在傷口上，并進行固定。在小鼠術后，定期進行換藥處理，并拍照、測量傷口面積，按以下公式計算傷口愈合率[18]：

(7)

式中：S0為手術后小鼠的傷口面積；St為拍照當天的傷口面積。

2 結果與分析

2.1 SA-PVA復合海綿的結構表征

SA、NFX、PS0、PS2和PS2-NFX的紅外光譜如圖2a所示。可知，SA在1 593、1 408、1 026 cm-1處的吸收峰分別對應CC、C—OH、C—O的伸縮振動[19]。NFX在1 720 cm-1處的吸收峰對應—COOH的伸縮振動，1 610 cm-1的吸收峰對應羥基吡啶酮[20]。PS0的紅外光譜在2 927 cm-1處的吸收峰分別對應C—H的伸縮振動；在3 293和1 087 cm-1處的吸收峰分別對應O—H伸縮振動和C—O的伸縮振動[21]。與PS0相比，PS2的特征峰的位置基本無變化，只是羥基峰略微變寬，這可能歸因于SA與PVA之間的氫鍵作用。在PS2-NFX的紅外光譜中，可以觀察到1 610 cm-1處的特征峰，證明復合海綿已經成功負載諾氟沙星。SA、PS0和PS4的XRD結果如圖2b所示。可以看出，SA的特征衍射峰出現(xiàn)在2θ=13.5°，2θ=22.0°[22]，PS0在2θ=19.6°、2θ=22.5°具有兩個特征衍射峰[9]。在SA-PVA的XRD圖譜中可以觀察到衍射峰2θ=19.6°、22.5°，且沒有其他衍射峰，表明SA與PVA已完全混合均勻，隨著SA質量分數(shù)的增加，在2θ=19.6°、22.5°處的衍射峰的強度降低且變得稍寬，這可能是由SA與PVA之間的氫鍵作用導致的。圖3為不同SA質量分數(shù)復合海綿的SEM圖?？芍?，復合海綿呈三維多孔結構，PS0、PS1、PS2和PS4的孔徑分別為62.45±19.8、66.8±19.7、68.15±21.0和71.9±17.2 μm。隨著SA質量分數(shù)的增加，復合海綿的孔徑增大，這可能是由于SA與PVA之間的氫鍵作用，使海綿網(wǎng)絡的交聯(lián)密度降低。該復合海綿的孔徑利于成纖維細胞的生長和遷移，有助于傷口愈合。

2.2 溶脹性、保濕性、降解性和孔隙率

不同SA質量分數(shù)復合海綿的溶脹性能如表1所示，可知，隨著復合海綿中SA質量分數(shù)的增加，其吸水性能增加，PS0的吸水率為500%，而PS4的吸水率能達到1 400%。一方面，由于SA與PVA之間的氫鍵作用，破壞了PVA本身的作用力，使海綿的網(wǎng)絡結構變得疏松，增加了對水分的吸收；另一方面，SA含有大量的羧基和羥基，提高了海綿的吸水性能。作為醫(yī)用敷料而言，良好的吸水性可以使敷料迅速吸收滲出液，所制備的復合海綿有良好的溶脹性能，能夠短時間內吸收大量液體，在促進高滲出性傷口的愈合方面有一定應用潛能[23]。表2為樣品的保水性變化曲線，可知，隨著復合海綿中SA質量分數(shù)的增加，海綿的保水性增加，原因可能是SA中含有大量的親水基團，增加了海綿的潤濕性和親水性，容易與水分結合，從而防止水分的蒸發(fā)。濕潤的環(huán)境可以提高傷口處細胞的遷移，從而加速傷口痊愈的過程。

表1 樣品的溶脹率

不同SA質量分數(shù)復合海綿的降解性能如表3所示，可知，隨著SA質量分數(shù)的增加，復合海綿的降解率呈遞增趨勢。第14天，PS0、PS1、PS2和PS4的降解率分別為31.7%、34.5%、37.8%和41.5%。其原因可能是PVA本身存在分子內作用力，SA的加入降低了復合海綿內部的氫鍵作用力，使得海綿的降解率增加。同時，海綿的降解速度緩慢，能夠保證海綿敷料在使用過程中的穩(wěn)定性。不同SA質量分數(shù)復合海綿的孔隙率如表4所示，可知，隨著SA質量分數(shù)的增加，復合海綿的孔隙率呈遞增趨勢。PS0、PS1、PS2及PS4的孔隙率分別為82.6%、87.4%、92%和95.1%。高孔隙率的敷料具有疏松多孔的結構，有助于吸收傷口處的滲出液。此外，表面多孔的結構利于營養(yǎng)物質的分散，使細胞更好的附著生長，從而加速傷口的愈合[24]。

表2 樣品的保水率

表3 樣品的生物降解率

2.3 SA-PVA復合海綿的生物相容性

復合海綿的溶血率結果如表5所示，可知，PS0、PS1、PS2、PS4的溶血率分別為1.49%、1.42%、1.17%和0.63%，溶血指數(shù)均低于極限值5%[25]。這可能歸因于海綿的制備過程中沒有使用任何有毒的化學試劑，PVA和SA都具有良好的親水性和生物相容性，說明制備的復合海綿屬于非溶血性材料，可用作傷口敷料。

表4 樣品的孔隙率

表6反應了3個時間點的CCK-8測試結果?？芍煌琒A質量分數(shù)的復合海綿的細胞存活率均在90%以上。結果表明，該復合海綿無毒性。圖4是NIH 3T3細胞在與PS0和PS2的浸提液共培養(yǎng)后細胞的生長情況。24 h時，樣品與空白組中均有少量的貼壁細胞，隨著時間的延長，細胞開始迅速增殖；48 h時，細胞大量增殖；72 h時，可見大量細胞密集生長，且生長趨勢良好。結果表明，該復合海綿具有良好的生物相容性，可用作促進傷口愈合的敷料。

表5 樣品的溶血率

表6 NIH 3T3細胞在樣品中培養(yǎng)不同時間時的細胞存活率

2.4 動物實驗結果

小鼠在手術當天及術后第5天、第15天、第20天的傷口愈合照片及傷口愈合率分別如圖5和表7所示。可知，與紗布對照組相比，PS2和PS2-NFX均能對傷口愈合起到促進作用，而經紗布組處理的傷口處的再生皮膚有明顯的疤痕。這可能歸因于紗布不能為傷口提供潮濕的環(huán)境，干燥結痂阻礙了細胞遷移。而海綿敷料在濕潤時，與人體皮膚有相近的柔軟性，利于細胞的生長遷移，從而加速傷口愈合。而與PS2相比，PS2-NFX組在創(chuàng)傷愈合方面的治療效果更優(yōu)。原因可能是濕潤的環(huán)境下細菌易生長，使傷口感染，而PS2-NFX可以有效地阻止細菌滋生，避免傷口細菌感染，促進傷口愈合[26]。由表7可知，在第20天時，用PS2-NFX組處理的傷口顯示84%的愈合率，高于其他兩組，原因可能是NFX具有良好的抗菌性，可有效降低傷口感染的機率，加速傷口愈合。綜上所述，制備的PS2-NFX傷口敷料可有效促進傷口愈合并減少疤痕形成。

表7 小鼠皮膚經樣品治療后的傷口愈合率

3 結論

本研究成功制備了SA-PVA復合海綿，并對其形態(tài)學、吸水性、保水性及降解性等進行了測試。結果顯示，所制備的復合海綿呈三維網(wǎng)絡結構，且適宜的孔徑有利于成纖維細胞的生長，具有促進細胞生長的孔隙率，具有維持創(chuàng)面水分平衡的吸水性和保水性。同時，SA-PVA復合海綿的降解速度緩慢，能夠保證海綿敷料在使用過程中的穩(wěn)定性，從而利于受傷部位的皮膚組織愈合，為其作為傷口敷料創(chuàng)造了條件。SA-PVA復合海綿的生物相容性測試結果顯示該敷料是一種無溶血性材料，具有良好的生物相容性。體內傷口愈合實驗表明，PS2-NFX可以加速傷口愈合過程。結果顯示，制備的傷口敷料在傷口愈合方面具有一定的潛能應用價值。