施嵐 許良飛 聶正超 常文嬌 馬筱玲

白血病是臨床常見的血液系統惡性腫瘤。近年來，表觀遺傳相關的調控失常已被證實在白血病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。由于與傳統基因序列改變不同，表觀遺傳修飾的可逆性為白血病藥物靶向治療提供了可能[1，2]。目前針對表觀遺傳修飾的靶向治療藥物研發(fā)已取得了很多突破性進展，如白血病常用化療藥物阿扎胞苷和地西他濱作為DNA甲基轉移酶抑制劑已經被批準應用于治療臨床骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）和急性髓細胞白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）[3，4]。另外甲基轉移酶EZH2和LSD1在白血病發(fā)病中的作用也有較多研究報道，其靶向治療藥物正在臨床預實驗階段[5，6]。以上研究成果提示表觀遺傳修飾在白血病的靶向治療領域具有良好的研發(fā)前景。

細菌毒素因為具有結合靶細胞的特異性和細胞毒性，目前已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的新熱點，一些毒素已被證明具有抗腫瘤活性，并顯示出良好的應用前景[7，8]。PVL（Panton-Valetine leukocidin）是金黃色葡萄球菌產生的細胞外毒素，由LukS-PV和LukFPV兩個亞單位組成[9]。補體C5a受體（component 5a receptor ，C5aR）是LukS-PV的結合位點，基于C5aR在髓系細胞膜上有較高表達，而在淋巴細胞膜上沒有表達的特性，LukS-PV對中性粒及單核在內的急性髓系白血病細胞有作用，而對急性淋巴細胞白血病則沒有作用[10]。課題組前期研究發(fā)現單組份LukS-PV細胞毒性較小，可通過結合C5aR或上調miR-125a調控細胞內相關信號通路誘導白血病細胞凋亡和分化，從而發(fā)揮抗白血病效應[11-14]。但LukS-PV是否可以通過表觀遺傳調控機制發(fā)揮生物學效應目前還不清楚。

SET8（PR-Set7/9，SETD8，KMT5A）是甲基轉移酶SET家族成員之一，其酶活性是特異性修飾組蛋白H4K20me1[15]。SET8 通過H4K20me1修飾參與了包括轉錄調節(jié)、細胞周期進展、基因復制和基因組穩(wěn)定性等多種重要的細胞生物學過程[16-19]。SET8在多種實體腫瘤中表達顯著增高，且與預后呈負相關[20-22]。然而，SET8在急性白血病中的作用和相關機制仍不清楚。

該實驗選用AML細胞系THP-1和HL-60，首先檢測LukS-PV對SET8的調控作用，進一步探究敲低SET8對白血病細胞增殖的影響，最后證實LukS-PV通過下調SET8影響白血病細胞的增殖。該研究提示SET8可以作為急性髓系白血病潛在的治療靶點，并為LukS-PV的抗白血病效應提供了新的分子機制。

材料與方法

1 細胞系和主要試劑 人急性髓系白血病細胞系THP-1細胞和HL-60細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；細胞培養(yǎng)所用的RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素購于美國Gibco公司；脂質體Lipo2000和RNA提取試劑TRIzol購于美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自美國KAPA公司；人SET8沉默的慢病毒載體購自上海吉瑪技術有限公司；實驗中所用引物由華大基因公司合成，以GAPDH作為內參；DMSO溶液購自上海生工生物工程有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒和蛋白裂解液RIPA購自上海碧云天生物技術有限公司；抗人SET8多克隆抗體、H4K20me1、GAPDH內參抗體購自美國CST公司；DyLightTM800標記的羊抗兔IgG二抗購自美國Rockland公司。

2 方法

2.1 LukS-PV的表達純化：取-80 ℃凍存的含重組表達載體pET28a-LukS-PV的大腸桿菌BL21（DE3）菌液，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對數生長期，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)6～8 h。離心收集細菌。用10 mL Binding Buffer重懸細菌，超聲破碎后離心，收集上清，用6×His親和層析柱（His·Band Purification Kit）純化。BCA法測定純化后的LukS-PV蛋白濃度。

2.2 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：離心收集細胞，預冷PBS洗滌1次，Trizol法抽提細胞總RNA，分光光度計測定RNA濃度。通過試劑盒逆轉錄為cDNA，按照試劑盒說明書操作，以GAPDH作為內參，ABI7500 PCR儀進行檢測。 目的基因擴增所用引物序列為：SET8: Forward，5'-ACTTACGGATTTCTACCCTGTC-3'，Reverse，5'-CGATGAGGTCAATCTTCATTCC-3'；GAPDH：Forward，5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，Reverse，5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA -3'。

2.3 慢病毒轉染及轉染效率驗證：將沉默SET8的慢病毒載體轉染THP-1細胞和HL-60細胞。轉染48 h后，用嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)。篩選7天后收取各組細胞，分別提取陰性對照組和沉默SET8組的細胞RNA及蛋白，qRT-PCR和WB檢測各組細胞中SET8的表達水平。

2.4 Western blot檢測：離心收集細胞，預冷PBS洗滌1次，提取細胞總蛋白。制備12%SDS聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE電泳；電泳結束后，以200 mA電流轉膜2 h，將NC膜置于10 mL封閉液（5%脫脂奶粉-PBS-0.05%Tween-20）中，室溫封閉2 h；抗人SET8多克隆抗體、H4K20me1、GAPDH內參抗體，4 ℃振搖孵育過夜；加入二抗（用封閉液1∶20 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG），室溫孵育2 h；加ECL發(fā)光試劑，檢測蛋白表達情況。

2.5 EdU檢測細胞增殖：用EdU試劑盒（keyGEN）檢測慢病毒敲低或過表達SET8以及LukS-PV處理后AML細胞THP-1和HL-60的增殖能力。EdU標記kFluor488，顯示綠色熒光。以每孔5 000個細胞接種于96孔板中，LukS-PV孵育24 h，加入50 nM EdU工作液孵育2.5 h，使用Hoechst 33342在黑暗中反染30 min。最后用流式細胞儀檢測EdU陽性細胞的比例。

2.6 統計學方法：所有資料數據均采用SPSS19.0軟件進行統計分析，所有計量數據均采用均數+標準差（+s） 表示。組間比較采用Student't-test，多組間的比較采用方差分析。所有實驗均重復3次，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LukS-PV下調AML細胞THP-1和HL-60的SET8表達用不同濃度（0，0.25，0.5，0.75和 1.0μM）LukSPV刺激AML細胞THP-1和HL-60后，通過qRT-PCR和WB檢測SET8的mRNA和蛋白表達水平，結果顯示與對照組相比，SET8 mRNA和蛋白水平明顯下調（P＜0.05）（圖1）。以上結果表明LukS-PV可以下調SET8表達并具有濃度依賴性。

2 LukS-PV在AML細胞THP-1和HL-60下調SET8介導的H4K20me1表達 已知SET8可以靶向修飾H4K20me1，那么LukS-PV是否可以通過SET8調控H4K20me1呢？WB檢測結果顯示不同濃度LukS-PV刺激白血病細胞THP-1和HL-60后，H4K20me1的水平與對照組相比，明顯下調（P＜0.05）（圖2）。以上結果表明LukS-PV可以下調SET8介導的H4K20me1表達并具有濃度依賴性。

3 SET8慢病毒載體敲低效率驗證 首先我們構建了穩(wěn)定敲低SET8的慢病毒載體，分別轉入白血病細胞系THP-1和HL-60進行篩選，并通過qRT-PCR和WB驗證敲低效率，且通過WB檢測進一步驗證敲低SET8可以下調H4K20me1的表達（P＜0.01）（圖3）。

4 敲低SET8抑制白血病細胞THP-1和HL-60的增殖通過EdU實驗檢測細胞增殖，結果顯示，與對照組相比，下調SET8可以抑制白血病細胞THP-1和HL-60的增殖，EdU陽性細胞的百分比分別為（56.4±2.6% VS 33.1±1.5%）和（38.0±1.8% VS 20.0±1.2%），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

5 LuKS-PV通過下調SET8抑制白血病細胞THP-1和HL-60的增殖 上述結果顯示LukS-PV可以下調SET8，而敲低SET8可以抑制白血病細胞THP-1和HL-60的增殖，那么LukS-PV是否可以通過下調SET8抑制白血病細胞THP-1和HL-60的增殖呢？為了驗證這一假設，我們首先在白血病細胞系THP-1和HL-60中敲低SET8，在此基礎上加入LukS-PV刺激，然后通過EdU檢測白血病細胞系THP-1和HL-60的增殖情況，結果顯示，與對照組相比，敲低SET8可以抑制細胞增殖，而再加入LukS-PV導致細胞增殖抑制更加明顯。以上結果表明LukS-PV通過下調SET8抑制白血病細胞THP-1和HL-60的增殖（圖5）。

討 論

細菌毒素由于對包括腫瘤細胞在內的靶細胞具有特異性的細胞毒性作用，在抗癌藥物的研發(fā)中受到越來越多的關注[7，8]。LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的細胞外毒素PVL的S組分[9]。課題組之前已報道LukS-PV在體內外均可誘導C5aR介導的AML細胞凋亡，并抑制其增殖[11-14]。然而，LukS-PV通過調控組蛋白修飾在AML細胞中發(fā)揮抗白血病作用的機制目前仍不清楚。

白血病是臨床常見的血液系統惡性腫瘤。其傳統的治療方式主要以化學藥物為主，該方式會導致非特異性細胞毒性和不可避免的耐藥性，因此，探索白血病新的靶向治療藥物是近年來研究的熱點。研究表明針對表觀遺傳修飾的靶向藥物在白血病的治療領域具有良好的研發(fā)前景。DNA甲基化和組蛋白修飾是目前表觀遺傳修飾研究領域關注的熱點。組蛋白修飾的種類較為復雜，白血病治療領域的研究則主要集中在組蛋白的甲基化和乙?；痆23，24]。很多甲基化修飾酶逐漸被發(fā)現在白血病發(fā)病中起重要作用。如研究較早也較廣泛的MLL1（又名KMT2A）是甲基轉移酶SET家族成員，多數AML患者中存在MLL1易位突變而影響干細胞的分化[25]。

SET8是含有SET結構域甲基轉移酶家族的成員之一，可以靶向修飾H4K20me1。SET8通過靶向調控H4K20me1介導的信號通路發(fā)揮生物學作用。其作用機制在不同類型腫瘤中有所不同，大致可總結為以下幾條路徑：活化WNT信號通路、刺激ERα靶基因的轉錄、抑制P53活性、與TWIST共同調控上皮間質轉化等，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-19]。如上所述，SET8的研究主要集中在調控下游靶基因和信號通路，而較少關注SET8上游被調控的方式。目前報道只有miR-7和miR-502可以靶向結合SET8 mRNA的3'UTR從而抑制其轉錄[22，26]。而我們的研究顯示LukS-PV靶向下調SET8，且下調SET8可以抑制白血病細胞的增殖，揭示了SET8調控的潛在機制，進而強調了調控SET8在急性髓系白血病治療中的重要性。

綜上所述，我們的研究表明LukS-PV在AML細胞THP-1和HL-60中通過下調SET8抑制細胞增殖。提示SET8是LukS-PV介導的AML治療的潛在靶點。但是這一現象是在急性髓系白血病細胞系THP-1和HL-60中發(fā)現的，接下來需要收集相關的臨床樣本，并采取體內實驗進一步驗證這一假設。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突