謝暉 曹小利 陳雨欣 周萬(wàn)青 沈瀚

大腸埃希菌是臨床常見(jiàn)的機(jī)會(huì)感染致病菌，常引起血流感染、尿路感染及呼吸道感染等[1]。大腸埃希菌是產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBL）的主要細(xì)菌，碳青霉烯類抗菌藥物是臨床治療產(chǎn)ESBLs腸桿科細(xì)菌的主要抗菌藥物[2]。隨著該類藥物的廣泛使用，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌（Carbapenem-resistantE. coli，CREC）在臨床檢出不斷增多，已成為全球面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題[3,4]。本研究主要對(duì)我院近幾年連續(xù)非重復(fù)分離的11株CREC進(jìn)行相關(guān)的分子特點(diǎn)分析。報(bào)道如下。

材料與方法

1 主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact及其配套GN鑒定卡和GN13藥敏卡（法國(guó)梅里埃公司）；Taq Mix（DBI公司）；PCR引物由上海生工公司合成；2720型PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司）；瓊脂糖（法國(guó)Biowest公司）；100 bp DNA Marker（大連Takara公司）；電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 菌株來(lái)源 收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院近幾年連續(xù)非重復(fù)分離碳青霉烯耐藥（以亞胺培南作為篩選標(biāo)準(zhǔn)）大腸埃希菌11株。樣本來(lái)源包括：分泌物3株、尿液3株、血液3株及痰液2株。使用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀鑒定菌種。blaNDM基因和blaKPC-2基因陽(yáng)性對(duì)照菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53來(lái)源于上海華山醫(yī)院抗生素研究所；大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

3 藥物敏感性試驗(yàn) 采用Vitek 2 Compact 及其配套GN13藥敏卡測(cè)定細(xì)菌對(duì)常規(guī)藥物的敏感性，測(cè)定藥物包括：亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、慶大霉素、頭孢唑林、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟及左氧氟沙星。藥敏結(jié)果的判定依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI M100 2019版標(biāo)準(zhǔn)[5]。大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株。

4 碳青霉烯耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。將新鮮培養(yǎng)的單菌落混懸于1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），13 000 r/min離心10 min后，棄上清，加入100 μL無(wú)菌水，在99 ℃金屬浴中放置10 min使細(xì)菌裂解，13 000 r/min離心5 min，上清即為模板，-20℃?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)合成碳青霉烯耐藥基因blaKPC、blaAIM、blaSIM、blaSPM、blaVIM、blaIMP、blaOXA、blaDIM、blaNDM、blaGIM和blaBIC引物[6]，引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Mix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送擎科生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行比對(duì)，確定基因型。

表1 碳青霉烯耐藥基因的引物序列及產(chǎn)物大小

5 多位點(diǎn)序列分型 依據(jù)網(wǎng)站提供的大腸埃希菌多位點(diǎn)序列分型引物及條件（https://bigsdb.pasteur.fr/ecoli/ecoli.html），合成7個(gè)管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA的擴(kuò)增引物后，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送擎科生物有限公司測(cè)序，并提交到網(wǎng)站進(jìn)行菌株的序列分型（https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_ecoli_seqdef）。

6 接合試驗(yàn) 挑取blaNDM陽(yáng)性菌株和疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53菌落分別接種于5 mL不含抗菌藥物的LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)6～8 h；取300 μLblaNDM陽(yáng)性菌株培養(yǎng)肉湯和700 μL疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53混勻入5 mL LB肉湯中，37℃ 200 r/min過(guò)夜；取100 μL混合培養(yǎng)液涂布到含有150 μL/mL疊氮鈉和2 μL/mL美羅培南的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落提取細(xì)菌DNA，使用PCR法驗(yàn)證blaNDM基因，使用腸桿菌基因間重復(fù)共有序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）PCR技術(shù)分析接合子與疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53和產(chǎn)blaNDM大腸埃希菌之間的遺傳相關(guān)性，進(jìn)而確定接合子。

結(jié) 果

1 藥物敏感性 大腸埃希菌對(duì)亞胺培南、厄他培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松和頭孢唑林、氨芐西林均具有較高耐藥性，耐藥率≥90%；對(duì)頭孢替坦和環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到88.2%，對(duì)慶大霉素的耐藥率達(dá)到72.7%，對(duì)左氧氟沙星、氨芐西林/舒巴坦和哌拉西林/舒巴坦的耐藥率達(dá)到63.6%，對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、妥布霉素、氨曲南耐藥性較低，耐藥率小于40%。

2 碳青霉烯耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 11株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌中，有9株檢出blaNDM（見(jiàn)圖1）基因，另2株未檢出。測(cè)序后證實(shí)8株攜帶blaNDM-5，1株攜帶blaNDM-4，有2株細(xì)菌同時(shí)攜帶blaNDM-5和blaKPC-2基因。

3 多位點(diǎn)序列分型結(jié)果 9株blaNDM陽(yáng)性大腸埃希菌分為7種ST型，其中有3株為ST167型，其余6株分別為ST6349、ST361、ST6335、ST617、ST7016和ST354型。

4 接合試驗(yàn) 9株blaNDM陽(yáng)性細(xì)菌均可獲得接合子，進(jìn)一步的分析證實(shí)為blaNDM基因接合子；但在2株同時(shí)攜帶blaNDM和blaKPC-2基因的大腸埃希菌的blaNDM接合子中未檢出blaKPC-2基因。

討 論

碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的出現(xiàn)及播散是全球面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題[4]。了解該類細(xì)菌的藥物敏感性、碳青霉烯耐藥基因的分布特點(diǎn)及多位點(diǎn)序列分型，對(duì)于臨床抗菌藥物的選擇及感染控制措施的制定具有很好的指導(dǎo)意義。

本文結(jié)果顯示，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌不僅對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物如亞胺培南、厄他培南具有較高的耐藥性，而且對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和慶大霉素等藥物的敏感性也不高，這與其他報(bào)道一致[3，7]，表明這種細(xì)菌引起的感染容易導(dǎo)致臨床抗感染治療藥物選擇的局限。值得注意的是，本研究中，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對(duì)氨曲南、阿米卡星、復(fù)方新諾明的敏感性相對(duì)較高，因此，對(duì)于由該類細(xì)菌造成的感染治療可考慮這些抗菌藥物的聯(lián)合治療策略。

有研究顯示，NDM的產(chǎn)生是大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯耐藥的主要機(jī)制[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，blaNDM基因在碳青霉烯耐藥大腸埃希菌中流行廣泛，這與以往的報(bào)道一致[9]。而在9株blaNDM基因陽(yáng)性菌株中，8株細(xì)菌攜帶的是blaNDM-5基因，表明NDM-5型碳青霉烯酶是介導(dǎo)我院大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制。另有1株細(xì)菌攜帶blaNDM-4基因，而目前對(duì)產(chǎn)NDM-4的大腸埃希菌也有報(bào)道[10]。

我們的接合試驗(yàn)結(jié)果表明，blaNDM基因是可轉(zhuǎn)移的，推測(cè)位于可接合質(zhì)粒上，需加強(qiáng)感染控制措施，防止該類基因的播散。同時(shí)，在從2株同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM基因的大腸埃希菌所獲得的接合子中，我們僅檢出了blaNDM基因，未檢出blaKPC-2基因。據(jù)此推測(cè)，攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒不攜帶blaKPC-2基因。雖然流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)blaKPC-2大多位于質(zhì)粒[11]，且關(guān)于blaKPC-2和blaNDM基因在同一質(zhì)粒中播散的情況也有報(bào)道[12]。本研究中，若blaKPC-2基因位于染色體上，便不會(huì)隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)移；若blaKPC-2基因位于質(zhì)粒，而接合試驗(yàn)的過(guò)程中，卻沒(méi)有和攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)移，很可能是blaKPC-2基因位于非接合的質(zhì)粒[13]，不可轉(zhuǎn)移；或者受體菌因?yàn)樯镞m應(yīng)性原因，只能獲得其中一種質(zhì)粒，而攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒與受體菌有更好的適應(yīng)性[13]，其轉(zhuǎn)移性優(yōu)于攜帶blaKPC-2基因的質(zhì)粒，導(dǎo)致只有攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而不伴有攜帶blaKPC-2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。這些推測(cè)都需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。然而，考慮到該類細(xì)菌同時(shí)攜帶兩種碳青霉烯耐藥基因，理應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)控，以免其播散而導(dǎo)致院內(nèi)暴發(fā)流行。

我們也發(fā)現(xiàn)，9株blaNDM陽(yáng)性大腸埃希菌的ST分型呈多樣化，表明該類細(xì)菌的播散不是以克隆流行為主，進(jìn)一步結(jié)合blaNDM存在于可接合質(zhì)粒上的發(fā)現(xiàn)，表明blaNDM主要通過(guò)質(zhì)粒的傳遞實(shí)現(xiàn)播散。此外，ST131型大腸埃希菌是國(guó)際常見(jiàn)克隆流行株[14]，而本研究未檢出ST131菌株。本研究發(fā)現(xiàn)，ST167是blaNDM陽(yáng)性大腸埃希菌的主要克隆型。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ST167大腸埃希菌是NDM-5/NDM-1及ESBL中CTX-M的主要宿主菌[15]，在日本、意大利、上海等地已被報(bào)道[16,17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)NDM-5的ST167型大腸埃希菌可在寵物與人之間播散[18]。因此需加強(qiáng)我院產(chǎn)NDM-5的ST167型大腸埃希菌的監(jiān)控并早期采取有效的隔離措施。

總而言之，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對(duì)臨床常用多種抗菌藥物高度耐藥， NDM酶的產(chǎn)生是主要的碳青霉烯耐藥機(jī)制，編碼該酶的基因主要存在于可接合的質(zhì)粒上，容易在大腸埃希菌中播散，需進(jìn)一步加強(qiáng)感染控制措施。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突