徐倩 姜黎明 歐陽(yáng)春

登革熱主要由攜帶登革病毒的白紋伊蚊（Aedes albopictus）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）叮咬人引起，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)每年全球超過(guò)100萬(wàn)人感染登革病毒，主要流行于亞熱帶和熱帶地區(qū)[1-3]。近些年，我國(guó)廣東、云南、臺(tái)灣、福建、江蘇和浙江等省均發(fā)生因輸入登革病毒感染病例引起的本地區(qū)疫情[2-4]。其中在2014年，我國(guó)廣東省廣州市爆發(fā)了近十年來(lái)最嚴(yán)重的登革熱疫情，共致40 000余人感染登革病毒，此次疫情對(duì)廣大人民群眾造成較嚴(yán)重的生命安全和身體健康影響，同時(shí)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生較大的負(fù)面影響[5，6]。另外，2015年，我國(guó)云南省西雙版納傣族自治州爆發(fā)了較嚴(yán)重的登革熱疫情，其中報(bào)道的登革熱病例超過(guò)1 000余例。目前由登革病毒造成的登革熱疫情是對(duì)我國(guó)傳染病防控的巨大挑戰(zhàn)[7]。與我國(guó)云南、廣西、海南和廣東相鄰的東南亞各個(gè)國(guó)家長(zhǎng)年有登革熱疫情，也是世界范圍內(nèi)登革熱流行最為嚴(yán)重的地區(qū)。新加坡、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、越南和緬甸等國(guó)的登革熱疫情均較為嚴(yán)重，又與我國(guó)廣西省、云南省及海南省接壤或隔海相望，近年來(lái)隨著經(jīng)貿(mào)繁榮發(fā)展，人員的流動(dòng)更加頻繁，這將加劇我國(guó)登革熱疫情的流行和發(fā)生，對(duì)社會(huì)安全和人民健康造成嚴(yán)重的危害和影響[8]。

黃病毒屬主要包括危害公共健康的西尼羅病毒（west nile virus，WNV)、黃熱病毒（yellow fever virus，YFV)、蜱傳腦炎病毒（tick-bome encephalitis virus, TBEV)、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV) 和登革病毒 (dengue virus，DENV)。黃病毒科間具有相似的基因組結(jié)構(gòu)、形態(tài)和大小，但它們之間的抗原抗體互作關(guān)系非常復(fù)雜，這種復(fù)雜的抗原抗體互作關(guān)系通常由病毒的E結(jié)構(gòu)蛋白介導(dǎo)，黃病毒的傳播媒介均為伊蚊[9-11]。黃病毒（JEV，DENV，ZIKA，WNV）基因組由包含約3 400個(gè)密碼子的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框的單鏈正義RNA組成。全基因組大小約為10 300～10 800 bp（ZIKA），10 800～11 000 bp（WNV），11 000 bp（JEV）和10 600～10 700 bp（DENV）。黃病毒基因組結(jié)構(gòu)蛋白N末端由衣殼蛋白、前膜蛋白和E蛋白組成，結(jié)構(gòu)蛋白之后為非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[12]。

目前大量研究表明黃病毒間存在抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象，即患者體內(nèi)血液中的亞中和濃度異型或異種病毒抗體能夠?qū)е轮匕Y病毒感染患者的出現(xiàn)。前期研究證明人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells，PBMCs）中存在登革病毒抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象[13]。另外，大量研究表明異型登革病毒抗體能夠在猴子模型和人單核細(xì)胞上誘發(fā)抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象[14，15]。為了研究乙腦病毒E蛋白抗體能否誘發(fā)Ⅱ型登革病毒產(chǎn)生抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象，本研究在人THP-1細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞）中探討分離自云南西雙版納傣族自治州重癥患者血清中的Ⅱ型登革病毒在乙腦病毒E蛋白抗體誘導(dǎo)下的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象，為更全面了解黃病毒間的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 病毒和細(xì)胞系 Ⅱ型DENV病毒分離自云南西雙版納傣族自治州重癥登革熱患者血清，由C6/36細(xì)胞系在CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)。人單核巨噬細(xì)胞THP-1保存于湖北省第三人民醫(yī)院。THP-1細(xì)胞和C6/36細(xì)胞均使用1640培養(yǎng)基（1%青鏈霉素，10% FBS）在37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)細(xì)胞密度達(dá)（1～2.5）×106/mL后，進(jìn)行傳代，約2～4天左右出現(xiàn)倍增。

2 Ⅱ型登革病毒在THP-1細(xì)胞系上乙腦病毒E蛋白抗體依賴增強(qiáng)感染模型建立 從細(xì)胞庫(kù)液氮中取出人THP-1細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，首先用1640培養(yǎng)基（10%FBS和1%青鏈霉素）在5% CO2和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿T25底層。在普通光學(xué)顯微鏡下對(duì)人THP-1細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，將人THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)接至24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔含1 mL（3×105個(gè)/mL）細(xì)胞液。用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基連續(xù)4倍稀釋JEV病毒糖蛋白單克隆抗體（Abcam，AB41671，0.8 mg/mL），由1/4稀釋至1/16、1/64、1/256、1/1 024，1/4 096，1/16 384，每個(gè)稀釋度為50 μL。將稀釋后的50 μLⅡ型登革病毒毒種分別與各個(gè)稀釋度的50 μL JEV-E抗體，空1640培養(yǎng)基或同型對(duì)照抗體混合后在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min。將孵育后的登革病毒乙腦E蛋白抗體復(fù)合物分別加入24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行吸附2 h；常溫對(duì)24孔板進(jìn)行800 r/min，3 min離心，離心后小心吸去上清并更換為新鮮1640培養(yǎng)液（1.5 mL/孔）繼續(xù)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行THP-1細(xì)胞上清的收集，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行Ⅱ型登革病毒拷貝數(shù)檢測(cè)。

3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Ⅱ型登革病毒全基因組序列，通過(guò)NCBI引物在線設(shè)計(jì)和引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0 (PREMIER Biosoft International，美國(guó)) 進(jìn)行Ⅱ型登革病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)完成的引物由中國(guó)上海生工生物有限公司合成，Ⅱ型登革病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 Ⅱ型登革病熒光定量PCR引物序列

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Ⅱ型登革病毒載量

4.1 Ⅱ型登革病毒載量檢測(cè)體系的建立：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（338 bp, 引物為DENVⅡ-F/R）連接到pMD-18T載體上以制備標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。用無(wú)菌去離子水對(duì)DENVⅡ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，接著進(jìn)行DENVⅡ標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的熒光定量PCR的檢測(cè)（定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃1 min，共35個(gè)循環(huán)）。通過(guò)Ct值與Ⅱ型登革病毒拷貝數(shù)間的線性關(guān)系建立Ⅱ型登革病毒定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.2 細(xì)胞及培養(yǎng)上清Ⅱ型登革病毒定量檢測(cè)：上述Ⅱ型登革病毒或Ⅱ型登革病毒與JEV-E抗體復(fù)合物感染THP-1細(xì)胞2 d后，離心收集上清液與細(xì)胞，并利用QIAGEN RNA提取試劑盒提取THP-1上清液總RNA。以獲得的總RNA為模板，通過(guò)mRNA selective PCR kit（TAKARA，大連）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，然后以逆轉(zhuǎn)錄獲得的單鏈cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀參照mRNA selective PCR kit（TAKARA，大連）說(shuō)明書進(jìn)行SYBR法的Ⅱ型登革病毒拷貝數(shù)絕對(duì)定量。

結(jié) 果

1 Ⅱ型登革病毒感染人THP-1細(xì)胞 Ⅱ型登革病毒感染人THP-1細(xì)胞后2 d收樣，通過(guò)透射電鏡觀察人THP-1細(xì)胞外觀形態(tài)，結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異及病變。其中圖1-Mock為正常培養(yǎng)的人THP-1細(xì)胞，圖1-DENVⅡ?yàn)榈歉锊《靖腥窘M，圖1-DENVⅡ+JEV-E為DENVⅡ與JEV-E 抗體共同孵育后感染人THP-1細(xì)胞，通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)DENVⅡ和DENVⅡ+JEV-E組THP-1細(xì)胞出現(xiàn)更多自噬小體，但THP-1細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生破碎、凝聚等病毒病變現(xiàn)象。

2 登革病毒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)pMD-18T載體上克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（338 bp, 引物為DENVⅡ-F/R）進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切圖譜顯示克隆成功（圖2）。通過(guò)定量檢測(cè)Ⅱ型登革病毒熒光定量PCR 的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)生成線性方程，結(jié)果如圖3所示，R2=0.997，結(jié)果顯示線性回歸度極高，表明該絕對(duì)定量PCR體系可用來(lái)進(jìn)行Ⅱ型登革病毒的熒光PCR定量檢測(cè)。

3 DENVⅡ型在人THP-1中的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象 1/4梯度稀釋的JEV-E 單克隆抗體與不同濃度的DENVⅡ型病毒復(fù)合感染人THP-1細(xì)胞，DENVⅡ型病毒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4），發(fā)現(xiàn)在MOI (Multiplicity of infection) =3，JEV-E單克隆抗體稀釋度為1/4時(shí)，人THP-1細(xì)胞上清中檢測(cè)到最多的DENVⅡ型病毒核酸（圖5），表明亞中和濃度JEV-E 單克隆抗體誘發(fā)DENVⅡ型病毒產(chǎn)生更強(qiáng)的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象。

以MOI=3的DENVⅡ型病毒感染人THP-1細(xì)胞，從圖5中可以看出1/4稀釋度的JEV-E單克隆抗體誘發(fā)最高濃度的DENVⅡ型病毒載量。在DENVⅡ型病毒以MOI=0.5感染人THP-1細(xì)胞時(shí)，此時(shí)病毒濃度更低，結(jié)果顯示JEV-E單克隆抗體誘發(fā)的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象較DENVⅡ型病毒MOI=3時(shí)更弱。

討 論

目前登革病毒抗體依賴增強(qiáng)感染的細(xì)胞模型及動(dòng)物模型主要為猴子、小鼠及單核細(xì)胞系[16，17]。登革病毒抗體依賴感染增強(qiáng)現(xiàn)象已被公認(rèn)是導(dǎo)致登革出血熱及登革休克綜合征（DHF/DSS）的主要原因，DHF/DSS也是嚴(yán)重制約登革疫苗開(kāi)發(fā)的瓶頸。本研究采用同為黃病毒屬的乙腦JEV-E單克隆抗體與不同濃度DENVⅡ型病毒復(fù)合感染人THP-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腦JEV-E單克隆抗體同樣可以誘發(fā)登革病毒產(chǎn)生抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象，即亞中和濃度（1/4）的JEV-E單克隆抗體促進(jìn)DENVⅡ型病毒在人THP-1細(xì)胞中的復(fù)制，這與前期在K562細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的登革病毒抗體依賴增強(qiáng)感染模型及異型登革病毒抗體介導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞上的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象具有一定的類似性[13，18]。本研究能夠?yàn)楦娴亓私獾歉锊《九c乙腦病毒間的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

同為黃病毒的登革病毒和乙腦病毒不僅具有相近的基因組大小及相同的結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因分布圖譜[12]，另外還具有相同的傳播媒介白紋伊蚊和埃及伊蚊，相同的高峰發(fā)病季節(jié)，以及重合的疫情流行區(qū)域[13，18，19]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)云南保山市人群乙腦IgG抗體陽(yáng)性率大于90%，本研究結(jié)果表明體內(nèi)血清中存在的乙腦抗體對(duì)登革病毒的作用取決于乙腦病毒抗體的水平，即1/4濃度的乙腦病毒E蛋白抗體具有促進(jìn)登革病毒復(fù)制的作用。反之，人體內(nèi)血清中存在的登革抗體對(duì)乙腦病毒的作用也是一個(gè)值得探索的方向。

隨著全球經(jīng)貿(mào)加劇、流行病爆發(fā)及傳播加速，一些新爆發(fā)的流行病沒(méi)有納入常規(guī)檢測(cè)，容易引發(fā)臨床輸血事故。特別是在登革和乙腦共同流行區(qū)域，由于供體血液及受體血樣中存在的登革病毒抗體和乙腦抗體可能誘發(fā)黃病毒間的抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象，因而在登革或乙腦疫情爆發(fā)期間進(jìn)行重癥患者的登革病毒抗體和乙腦病毒抗體的定量檢測(cè)，對(duì)于研究重癥患者與黃病毒間抗體依賴增強(qiáng)感染的聯(lián)系，更全面地認(rèn)識(shí)登革和乙腦重癥患者具有重要的指導(dǎo)意義。因此建議臨床上有必要在登革和乙腦疫情地區(qū)對(duì)血樣進(jìn)行特殊檢測(cè)，同時(shí)在輸血前對(duì)血液進(jìn)行登革和乙腦抗體水平的二次檢測(cè)，特別要對(duì)可能存在抗體依賴增強(qiáng)感染的病毒抗體進(jìn)行輸血前二次檢測(cè)。由于黃病毒間存在抗體依賴增強(qiáng)感染現(xiàn)象，在疫情地區(qū)，特別是廣東、云南等登革病毒流行區(qū)進(jìn)行人群的登革病毒檢測(cè)對(duì)于輸血安全及防控登革疫情具有重要指導(dǎo)意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突