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乙型肝炎是由HBV經血液、母嬰和性接觸等傳播途徑感染人體所致的急、慢性肝臟炎性病變。2020年7月27日，WHO公布的數(shù)據顯示乙型肝炎流行率最高的是世衛(wèi)組織西太平洋區(qū)域和世衛(wèi)組織非洲區(qū)域，成年人感染率分別為6.2%和6.1%[1]。中國作為全球乙型肝炎高發(fā)的國家，在慢性乙型肝炎，乙型肝炎后肝硬化和原發(fā)性肝癌的治療上花費巨大的成本[2]。所以乙型肝炎篩查在乙型肝炎防治工作中具有重大的意義。

乙型肝炎檢測主要包括HBV血清學標志物檢測及HBV DNA檢測[3]，傳統(tǒng)的慢性HBV感染檢測是針對血清中HBsAg。越來越多資料和研究表明，無論是急性自限性肝炎，還是成功進行抗HBV治療后慢性乙型肝炎患者，HBsAg清除后部分患者肝組織中仍可檢出HBV DNA，而HBsAg及HBeAg無反應性，而血清中可檢測到低水平HBV DNA或肝組織檢測出乙肝病毒環(huán)狀部分雙鏈DNA（HBV rcDNA）和（或）共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）稱隱匿性HBV感染（Occult hepatitis B infection，OBI），OBI患者的肝臟損害并沒有停止，仍可進展為肝硬化或肝癌[4，5]。既往有HBV感染史、免疫抑制或化療狀態(tài)的OBI感染者可能會發(fā)生OBI的重新激活，即重新啟動病毒復制[4-6]。曾有研究報道，獻血人群中存在OBI供血者，導致輸血后的HBV傳播[7]。核酸檢測是直接檢測病毒基因組，被報道對OBI有較好的檢出效果。為了保障血源安全，我國在2010年開展了HBV核酸檢測血液篩查試點工作，并于2015年將其正式納入血液篩查范疇[8]。

目前，國內HBV DNA檢測用于臨床HBV篩查的研究較少，醫(yī)療機構仍然以HBsAg檢測為主，為了探討HBV DNA檢測的臨床意義。我們進行了一項多中心臨床試驗研究，收集了23家單位HBV血清學及核酸檢測結果，經嚴格的納入與排除標準，分析了HBsAg無反應性標本中的 HBV DNA定性檢測結果，發(fā)現(xiàn)HBV核酸檢測能從HBsAg無反應性標本檢出一定比率的乙型肝炎患者，特別對OBI患者具有較好的檢出效果。

材料與方法

1 研究對象 收集2019年10月～2020年6月期間，全國23家醫(yī)院標本的HBV血清學和核酸檢測結果信息。首次納入標準：血清學檢測HBsAg無反應性。二次納入標準（同時滿足以下條件）：①血清HBV DNA定性檢測陽性；②進行了HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb血清學標志物檢測。

2 倫理審查聲明 本研究已在ClinicalTrials.gov注冊（注冊號為NCT04471688）。并通過了中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準（批件號為2019-S483）。

3 試劑與方法

3.1 HBV DNA定性檢測：按照乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）（圣湘生物科技股份有限公司）說明書對標本進行核酸提取與HBV DNA定性檢測，最低檢出限（Limit Of Detection, LOD）為3 IU/mL，經過了國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心批準的康徹斯坦血清盤驗證，在0.5倍LOD、1倍LOD與3倍LOD時均能100%檢出。每份標本取樣量0.96 mL，在全自動核酸提取儀Hamilton STAR進行核酸提取。提取結束后，核酸與磁珠一起加入到50 μL PCR反應體系中，封好膜，放入PCR儀樣品槽進行檢測。

3.2 HBV血清學標志物檢測試劑及方法：23家醫(yī)院采購的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb血清學標志物檢測試劑來自雅培、安圖、羅氏、希森美康、科美、北京萬泰、廈門新創(chuàng)、愛康、英科新創(chuàng)、珠海麗珠、邁瑞、廣州豐華、貝克曼、科華、蘇州新波、長光、邁克和VITROS，血清學標志物檢測方法學分為化學發(fā)光免疫分析法和ELISA法。

4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據使用描述性統(tǒng)計進行總結。表示為例數(shù)和比值[n（%）]。

結 果

1 HBV血清學及核酸檢測標本研究數(shù)據收集 收集2019年9月～2020年6月期間全國23家單位10 173例標本的HBV血清學和核酸檢測結果信息。經首次納入及排除標準，納入HBsAg無反應性檢測標本共9 186例，進行血清HBV DNA定性檢測結果分析。再對HBV DNA檢測為陽性標本數(shù)據，經二次納入及排除標準，最終納入HBV DNA陽性，HBsAg無反應性，且進行了HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb檢測的標本168例（圖1）。

2 HBsAg 無反應性標本中的 HBV DNA定性檢測結果分析 如表1所示，10 173例HBV標本的血清學與核酸檢測結果顯示：987例標本呈HBsAg反應性，其中HBsAg（+）HBV DNA（+）為888例（8.73%），HBsAg（+）HBV DNA（-）為99例（0.97%）；9 186例（90.30%）HBsAg無反應性標本中，HBsAg（-）HBV DNA（-）標本為8 932例（87.8%），HBsAg（-）HBV DNA(+)為254例（2.77%）

表1 10 173例HBV標本血清學與核酸檢測結果分析

3 168例HBsAg無反應性標本的HBV核酸定性分析 患者乙肝病毒DNA載量低時，HBsAg檢測易出現(xiàn)假陰性結果。為了研究HBsAg假陰性結果與標本HBV DNA核酸濃度的關系，我們對二次納入的168例HBsAg無反應性標本進行了HBV DNA載量的分析。通過濃度已知的HBV標準品及其PCR檢測Ct值，我們構建了HBV DNA濃度與Ct值的標準曲線（圖2A）。對168例HBsAg無反應性標本進行HBV DNA檢測的Ct值分析，發(fā)現(xiàn)166例（98.81%）標本的HBV核酸檢測Ct值＞31（圖2B）。結合標準曲線分析，我們發(fā)現(xiàn)當標本HBV核酸濃度為低于200 IU/mL時，HBsAg檢測易出現(xiàn)假陰性，而HBV DNA檢測仍具有極好的準確率。

4 168例HBsAg無反應性標本的血清學標志物結果分析 二次納入的168例標本的血清學標志物結果分析，表明共有8種HBV血清學標志物組合模式（見表2），其中模式1[僅HBsAb，HBcAb為反應性]為27例（16.07%），模式2[僅HBsAb、HBeAb、HBcAb為反應性]為23例（13.69%），模式3[僅HBeAb、HBcAb為反應性]為26例（15.48%），模式4[僅HBcAb為反應性]為18例（10.71%），模式5[HBV血清學標志物全無反應性]為15例（8.93%），模式6[僅HBsAb、HBeAb為反應性]為7例（4.17%）,模式7（僅HBsAb為反應性）為48例（28.57%），模式8（僅HBeAb為反應性）為4例（2.38%）。

另外，168例標本中無任何血清學標志物反應的15例（8.93%）；抗-HBc反應性有94例（55.95%），抗-HBc無反應性為74例（44.05%）；同時，全部的168例標本中HBeAg均為無反應性，說明HBV核酸檢測能防止HBeAg（-）慢性乙型肝炎漏檢。

討 論

精確的乙型肝炎病毒篩查技術，在乙型肝炎嚴重流行的我國極為重要[9，10]。雖然，目前我國大部分醫(yī)院采用的乙型肝炎血清學標志物檢測方法（化學發(fā)光免疫分析法及ELISA法）敏感度及特異度均較高[11]，但對乙型肝炎免疫窗口期患者、OBI患者和HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者的檢出率仍不理想。而且乙型肝炎患者經過治療后，其乙型肝炎核心抗體和乙型肝炎表面抗原抗體可能長時間存在，加上乙型肝炎病毒基因突變等問題，單純的HBV血清學標志物檢測方法，可能無法滿足臨床上對乙型肝炎篩查需要。核酸篩查是直接基因組檢測，被認為是病原體檢測的金標準，有報道稱HBV核酸檢測對于OBI和窗口期感染等HBV潛在患者檢出非常重要[12]。

表2 HBsAg無反應性,血清HBV DNA定性檢測陽性患者血清學標志物模式

本研究中，我們共收集了全國23家單位的10 173例標本的HBV血清學及核酸檢測結果，發(fā)現(xiàn)9 820例（96.53%）HBsAg與HBV DNA檢測結果一致，與前人研究的兩種檢測方法結果一致性比率相似[13]。檢測結果不一致標本中，99例（0.97%）標本檢測為HBsAg（+）HBV DNA（-），可能與HBsAg假陽性或者治療后患者病毒載量太低無法檢出核酸有關[14]。同時，我們對二次納入的168例HBsAg（-）HBV DNA（+）樣品，進行了HBV核酸濃度定量和Ct值分布分析，發(fā)現(xiàn)166例樣品的HBV DNA濃度低于200 IU/mL。OBI患者的HBsAg為無反應性，且HBV核酸濃度通常低于200 IU/mL[15]，因此，我們推測這166例（98.81%）為OBI患者標本，且HBV DNA檢測對OBI患者具有很好的檢出效果。其次，168例樣品中抗-HBc反應性OBI患者有94例（55.95%），而無HBeAg反應性標本，暗示可能存在一定比率的HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者。HBeAg（-）慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒出現(xiàn)C區(qū)變異或核心區(qū)啟動子變異，表現(xiàn)為乙型肝炎e抗原不能表達故不能在血清學中被檢出，但同時由于核心抗原和e抗原有交叉反應，在血清中卻可以查到乙型肝炎e抗體[16]，因此，HBV核酸檢測是防止HBeAg（-）慢性乙型肝炎漏檢主要手段之一。另外，我們發(fā)現(xiàn)了15例無任何血清學反應的HBV DNA陽性標本，說明可能存在新型的乙型肝炎患者，產生了突變的抗原或抗體而不被現(xiàn)有的血清學免疫試劑所識別，但也不能排除可能由于檢測過程導致的誤差，或者新的免疫學產生或病毒突變等因素。

綜上所述，HBV DNA檢測能從HBsAg無反應性標本中有效發(fā)現(xiàn)低病毒載量的乙型肝炎患者，特別是能有效檢出OBI和HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者，防止血清學漏檢。OBI患者和HBeAg（-）慢性乙型肝炎患者，均可發(fā)生乙型肝炎病毒激活，導致肝硬化、肝癌和肝衰竭等終末期肝病的風險[15，17]。因此，臨床上我們建議普及HBV DNA篩查。本研究存在一定的局限性，比如各研究單位檢測血清學指標的方法學及試劑的不統(tǒng)一，實驗室條件不同可能造成實驗結果存在誤差等。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突