宋立民　李明澤　李仰真　馬林　吳會民　劉義　李楠

摘要 為評價遺傳背景、體重、黑化、運輸應激等對牙鲆（Paralichthys olivaceus）血清免疫學指標的影響，以引進的“鲆優(yōu)2號”抗病牙鲆和普通牙鲆為試驗材料，通過肉眼區(qū)分無眼側有無黑化，在不同生長階段采集樣本，采樣前有無施行包裝運輸?shù)仁侄?，將研究對象分?個試驗組，分別測定溶菌酶（LYS）活力、酸性磷酸酶（ACP）活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力、免疫球蛋白M（IgM）含量、補體3（C3）和補體4（C4）含量等6種免疫學指標。結果表明：試驗組1各項檢測指標均低于試驗組2，但差異均不顯著（P>0.05）;試驗組4各項檢測指標均低于試驗組7，其中LYS、ACP、SOD活力及IgM含量差異極顯著（P<0.01），C4含量差異顯著（P<0.05），C3含量差異不顯著（P>0.05）;試驗組1各檢測指標均低于試驗組7，且差異超級顯著（P<0.001）;試驗組2各檢測指標均小于試驗組4，SOD活力及IgM、C3含量差異超級顯著（P<0.001），LYS活力差異極顯著（P<0.01），C4含量差異顯著（P<0.05），ACP活力無顯著差異;試驗組3與試驗組4各指標差異均不顯著（P>0.05）;比較試驗組5、試驗組6與試驗組7的檢測結果發(fā)現(xiàn)，只有試驗組5中C3含量極顯著低于試驗組6（P<0.01），其余指標差異均不顯著。通過一定的育種手段可使養(yǎng)殖對象在某一個或多個方面獲得可遺傳的免疫優(yōu)勢;隨著牙鲆個體的生長，體重增加，抗病力逐漸增強;牙鲆的抗病能力與黑化與否的相關性未達到顯著水平;對于同一遺傳背景，經歷運輸（未產生休克）與未經歷運輸樣本魚的6種免疫學指標差異不顯著。

關鍵詞 牙鲆;遺傳背景;體重;黑化;運輸應激;免疫學指標

中圖分類號 S917.4文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）22-0094-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.025

Comparison of Serum Immune Indices of Paralichthys olivaceus under Different Conditions

SONG Li-min1， LI Ming-ze1， LI Yang-zhen2 et al

（1. Tianjin Fishery Research Institute， Tianjin 300221;2. Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences （CAFS）， Qingdao，Shandong? 266071）

Abstract In order to evaluate the influence of genetic background， body weight， hypermelanosis and transportation stress on the serum immune indices of Paralichthys olivaceus， the subjects were divided into 7 experimental groups， according to blind-side with hypermelanosis or not， different growth stages， and sampling with transportation stress or not， from the resistant flounder and common flounder which were used as experimental materials. Lysozyme （LYS） activity， acid phosphatase （ACP） activity， superoxide dismutase （SOD） activity， immunoglobulin M （IgM） content， complement C3 content， C4 content were measured and compared separately of the above groups. The results indicated that the test items of experimental group 1 were less than those of group 2， but the difference was not significant （P>0.05）.The test items of experimental group 4 were lower than those of group 7， and there were highly significant differences （P<0.01） in LYS activity， ACP activity， SOD activity and IgM content， while the difference in C4 content was significant （P<0.05）， there was no significant difference （P>0.05） in C3 content.The test items of experimental group 1 were lower than those of group 7， and the difference were super significant （P<0.001）.The test items of experimental group 2 were lower than those of group 4， and there were super significant differences （P<0.001） in SOD activity， IgM content and C3 content， while highly significant difference （P<0.01） in LYS activity， significant difference （P<0.05） in C4 content， no significant difference （P>0.05） in ACP activity.There were no significant difference （P>0.05） in 6 immune indices between experimental group 3 and group 4.Only C3 content of group 5 was highly significant （P<0.01） lower than that of group 6， by comparing the test items of experimental group 5， group 6 and group 7. The results showed that heritable immune advantage in one or more aspects could be obtained by cultured animals， according to certain breeding methods.The disease resistance was gradually increased with the growth of Paralichthys olivaceus individuals.There was no significant correlation between immune indices and blind-side with hypermelanosis or not of Paralichthys olivaceus.The same result as above was obtained about sampling with transportation stress （which was not an approaching death shock） or not in this experiment.

Key words Paralichthys olivaceus;Genetic background;Body weight;Hypermelanosis;Transportation stress;Immune indices

基金項目 天津市農業(yè)發(fā)展服務中心青年科技創(chuàng)新項目（ZXKJ201908，ZXKJ201911）。

作者簡介 宋立民（1982—），男，河北秦皇島人，工程師，碩士，從事水產養(yǎng)殖與育種研究。*通信作者，工程師，碩士，從事水產養(yǎng)殖研究。

收稿日期 2020-05-31

牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬于鰈形目鰈亞目牙鲆科牙鲆屬，以黃渤海區(qū)分布較多，其主要捕食底棲非經濟魚類及甲殼類，肉質細嫩鮮美[1]，是我國重要的海水養(yǎng)殖品種之一。鑒于牙鲆養(yǎng)殖過程中，周年可發(fā)生腹水病害，研究表明其主要致病菌之一是遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）[2-4]，陳松林團隊通過多年努力培育出抗遲緩愛德華氏菌病能力強、生長較快的牙鲆新品種——“鲆優(yōu)2號”，為減少養(yǎng)殖牙鲆病害發(fā)生、發(fā)展無抗養(yǎng)殖提供了新思路[5]。筆者所在課題組于2018年引進“鲆優(yōu)2號”牙鲆抗病苗種，試養(yǎng)期間采集了新品種牙鲆和普通牙鲆的血清樣本，用于測定其溶菌酶活力（LYS）、酸性磷酸酶活力（ACP）、超氧化物歧化酶活力（SOD）、免疫球蛋白M含量（IgM）、補體3（C3）和補體4（C4）含量等重要免疫學指標，依據(jù)牙鲆不同遺傳背景、不同體重、無眼側有無黑化、采樣前有無運輸應激等分成不同試驗組，并對測定的免疫學指標進行比較，以期為“鲆優(yōu)2號”牙鲆新品種的抗病原理研究提供免疫學依據(jù)，同時為進一步研究牙鲆免疫學指標的影響因素積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚來源及飼養(yǎng)條件

“鲆優(yōu)2號”牙鲆新品種購于海陽市黃海水產有限公司，普通牙鲆購于秦皇島啟民水產養(yǎng)殖有限公司，二者飼養(yǎng)條件相同。試驗地位于天津市民峰水產有限公司，使用飼料為萊州鴻頤水產有限公司生產的“海童”牌鲆鰈類配合飼料，水泥池面積40 m2，苗種規(guī)格為200 g左右時放養(yǎng)密度為32尾/m2，苗種規(guī)格為600 g左右時放養(yǎng)密度為17尾/m2，養(yǎng)殖方式為流水養(yǎng)殖，水溫18.0～21.5 ℃，溶解氧含量6.14～8.02 mg/L，pH 8.0～8.2，鹽度26‰。

1.2 試驗分組與樣本采集

依據(jù)遺傳背景，分為普通牙鲆和選育的“鲆優(yōu)2號”牙鲆新品種兩大群體;依據(jù)體重規(guī)格，可分為200和600 g兩個生長階段。依據(jù)無眼側有無黑化（圖1），從普通牙鲆苗群體中分別采集黑化樣本和正常樣本;另外依據(jù)采樣前有無進行運輸應急，從牙鲆新品種群體中采集應激樣本和未應激樣本，具體情況如表1所示。

采樣前進行打包運輸操作，參照米紅波等[6]的方法并根據(jù)實際條件進行調整。運輸包裝采用透明PE平口袋（長90 cm、寬60 cm），運輸用水采用曝氣井水，pH 8.3，水溫21.5 ℃，鹽度26‰，溶解氧含量8.02 mg/L。包裝袋內注入1/3的水，每袋放入2尾牙鲆，充氣，封口。歷時80 min運至實驗室。表1中試驗組5樣本規(guī)格較大，分4次打包，歷時110 min運至實驗室，其中6尾無呼吸動作、產生休克，另2尾呼吸動作虛弱，將休克魚送至實驗室，立即采集血樣;試驗組6樣本沒有經歷運輸應急，試驗魚從養(yǎng)殖車間現(xiàn)場撈取，直接進行血液采集。

1.3 血清樣本的制備和部分免疫學指標的測定

血清樣本采集參考姜宏波[7]方法，并做適當改動。具體方法如下：試驗魚禁食24 h后，使用200～400 μL/L乙二醇苯醚麻醉，用2 mL注射器于尾部靜脈迅速抽取1.0～1.5 mL血液，緩慢注入2 mL無菌離心管中，于4 ℃冰箱中靜置2 h，以3 000 r/min 轉速離心15 min，分離獲得上清液（即血清）;用0.2 mL無菌離心管分裝密封，-80 ℃下冷凍待測。保存過程中若出現(xiàn)沉淀，則必須再次離心，重新收集上清液。試驗所需試劑盒購于上海紀寧實業(yè)有限公司，使用Rayto RT-6100酶標分析儀進行部分免疫學指標檢測。檢測指標包括溶菌酶（LYS）活力、酸性磷酸酶（ACP）活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力、免疫球蛋白M（IgM）含量、補體蛋白3（C3）含量、補體蛋白4（C4）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（Mean ± SD）表示。使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異超級顯著，使用Excel 2010軟件繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 不同遺傳背景對牙鲆血清免疫學指標的影響

從圖2可以看出，試驗組1各項檢測指標均低于試驗組2，但差異均不顯著（P>0.05）。試驗組4各項檢測指標均低于試驗組7，其中LYS活力、ACP活力、SOD活力、IgM含量差異極顯著（P<0.01）;C4含量差異顯著（P<0.05）;C3含量差異不顯著（P>0.05）。試驗組1、試驗組4是從秦皇島啟民水產養(yǎng)殖有限公司購得的普通牙鲆，試驗組2、試驗組7是從海陽市黃海水產有限公司購得的選育新品種“鲆優(yōu)2號”，試驗組1、4與試驗組2、7遺傳背景不同，檢測結果表明經過選育的“鲆優(yōu)2號”牙鲆上述血清免疫學指標比普通牙鲆更有優(yōu)勢，并隨著個體的生長發(fā)育，新品種免疫學優(yōu)勢呈增強趨勢。

2.2 不同體重對牙鲆血清免疫學指標的影響

從圖3可以看出，試驗組1各項檢測指標均低于試驗組7，且差異超級顯著（P<0.001）;試驗組2各項檢測指標均低于試驗組4，SOD活力、IgM含量、C3含量差異超級顯著（P<0.001），LYS活力差異極顯著（P<0.01），C4含量差異顯著（P<0.05），ACP活力無顯著差異（P>0.05）。試驗組1牙鲆平均體重（213.30±9.17）g，試驗組2平均體重（200.12±13.17）g，二者差異不顯著（P>0.05）;試驗組4牙鲆平均體重為（586.39±2695）g，試驗組7平均體重為（588.68±9.33）g，二者差異不顯著（P>0.05）;試驗組1、7與試驗組2、4牙鲆的生長階段不同，依照試驗總體結果，隨著牙鲆個體的生長，其血清免疫學指標產生變化，抗病力逐漸增強，這種趨勢在“鲆優(yōu)2號”牙鲆群體中表現(xiàn)尤為明顯。

2.3 無眼側黑化與正常牙鲆血清免疫學指標比較

從圖4可以看出，試驗組3、4試驗魚均為購自秦皇島啟民水產養(yǎng)殖有限公司的普通牙鲆，試養(yǎng)環(huán)境相同，無眼側體色不同，各檢測指標差異均不顯著（P>0.05），說明牙鲆無眼側黑化與否與所測指標在血清中的水平無顯著相關。

2.4 不同運輸應激對牙鲆免疫學指標的影響

從圖5可以看出，試驗組5、6與試驗組7牙鲆體重差異不顯著，采樣前樣本魚經歷操作方式不同，各檢測指標中，只有試驗組5中C3含量極顯著低于試驗組6（P<0.01），其余值差異均不顯著。樣本魚在短暫運輸過程中沒有對檢測指標產生明顯影響，但如果樣本魚受到一定程度的應激（比如發(fā)生休克），則會對某些指標產生顯著影響，其中C3含量在6種檢測指標中表現(xiàn)更為敏感。

3 討論

3.1 選擇6種指標初步評價免疫力的原因

LYS在抵抗外來病原入侵中起著重要的作用[8]。LYS能破壞細胞壁中的肽聚糖，使細菌細胞崩解[9];此外，它還能激活補體旁路和吞噬細胞活性，參與機體非特異性免疫防御[10]。LYS 是非常重要的免疫因子，其活性高低反映水生生物非特異性免疫水平的高低，因此有很多研究都采用LYS作為重要的免疫學指標[11-13]。ACP廣泛分布于生物界[13]，是巨噬細胞溶酶體的標志酶之一，參與動物機體的免疫活動[14-15]。SOD廣泛分布于機體血液和各組織器官中，是生物體中最先對活性氧自由基作出反應的抗氧化酶[16]。免疫球蛋白是魚類特異性體液免疫應答的主要介質[17]。目前魚類是最早產生免疫球蛋白的脊椎動物，可能僅有免疫球蛋白IgM[14]。IgM含量通常被認為是評價魚體免疫應答反應的重要指標[9]。魚類的補體系統(tǒng)通過吞噬細胞協(xié)助作用來溶解外來細胞和外來生物體[18]，同時參與特異性和非特異性免疫[19]，其中C3和C4在補體系統(tǒng)中擔當著重要角色[20]。因此，該試驗選擇上述6種指標來評估牙鲆免疫水平。

3.2 不同遺傳背景對牙鲆免疫力的影響

姜宏波等[21]認為血液中的一些指標是反映機體健康狀況及抗病力的重要參數(shù)，對克隆牙鲆與普通牙鲆血液生理生化指標的研究表明遺傳因素是影響這些指標的重要方面。田岳強等[22]對大菱鲆（Scophthalmus maximus）選育家系與普通家系LYS、IgM等7種非特異免疫因子在肝臟、脾臟與頭腎中的表達量研究表明攻毒前后6 個選育家系免疫因子的表達量均高于普通組。劉堃等[23]研究表明抗病草魚（Ctenopharyngodon idellus）血液中免疫球蛋白IgM轉錄本豐度、LYS含量等部分免疫學生化指標顯著高于普通草魚（P<0.05）。楊啟蓮等[24]研究表明選育的“閩優(yōu)1 號”大黃魚（Larimichthys crocea）血清LYS活力和血細胞SOD活力均顯著高于對照組（P<0.05），而血清中的免疫球蛋白含量低于普通養(yǎng)殖群體。該試驗在生理水平上同樣證明經過相同階段試養(yǎng)，人工選育的“鲆優(yōu)2號”牙鲆新品種比普通牙鲆更具免疫優(yōu)勢，只是不同生長階段優(yōu)勢差異程度不同，而且各評價指標隨著生長發(fā)育的提升程度亦不同，如試驗中補體C3含量的變化程度相對其他5種指標較小，可能是由于其自身生理機制的特點以及定向選育操作的影響。綜上所述，通過選擇育種等手段可以使養(yǎng)殖對象在某一個或多個方面獲得可遺傳的免疫優(yōu)勢，但不同指標在不同種類、機體不同部位中的表達結果存在差異，這需要對免疫應答機理進行更深入研究。

3.3 不同體重對牙鲆免疫力的影響

李澤宇[25]在建立牙鲆抗遲緩愛德華氏菌病家系的研究中發(fā)現(xiàn)牙鲆魚的全長、體重等生長性狀與抗病力呈極顯著正相關。對哺乳動物豬的研究發(fā)現(xiàn)，仔豬體重越大，免疫力和抗病力越強[26]，且相同生長期大個體的抗病力要強于小個體。該試驗養(yǎng)殖過程中，隨著牙鲆個體的生長，體重增加，抗病力逐漸增強，與前述研究結果類似，然而也存在與該試驗不同的研究結果。侯吉倫等[27]在牙鲆抗淋巴囊腫病家系的選育過程中發(fā)現(xiàn)牙鲆淋巴囊腫抗病和患病個體間的體重和體長差異均不顯著，這可能與抗病性能評判標準不同有關。該試驗是以血清中幾種免疫相關酶為評價指標，間接評估試驗組魚的抗病力，而李澤宇[25]是以試驗牙鲆人工感染遲緩愛德華氏菌后的成活率，侯吉倫等[27]是以在患病環(huán)境中飼養(yǎng)、出現(xiàn)淋巴囊腫癥狀為標準進行評價，同時不同致病菌造成機體免疫應答機制產生差異也是可能原因之一。穆秀瓊[28]在對吉富羅非魚的養(yǎng)殖試驗表明，7周后各家系的總超氧化物歧化酶活力、LYS活力分別與體重增長呈顯著正相關，即體重增長較快的家系其總超氧化物歧化酶水平也較高;試驗14周和21周后卻表現(xiàn)為體重的增長分別與SOD活力、LYS活力的變化沒有顯著相關性[28]。這可能與選取的試驗對象種類、生長階段和養(yǎng)殖方式不同有關。依照該試驗結果，“鲆優(yōu)2號”牙鲆群體中體重增加對血清免疫學指標產生的影響比普通群體更為明顯，這可能與“鲆優(yōu)2號”牙鲆經過選育個體差異較小，所獲得抗病力隨著體重的增長而逐漸增強有關。

3.4 無眼側有無黑化對牙鲆免疫力的影響

“黑化”指的是無眼側出現(xiàn)黑斑，即黑色素細胞增加。養(yǎng)殖環(huán)境、密度、營養(yǎng)等都能夠對牙鲆的體色產生影響[29-30]，亦能夠直接或間接影響魚類免疫力[31-33]。相關研究表明，金黃殼色馬氏珠母貝（Pinctada fuctada martensii）群體與養(yǎng)殖群體血清免疫酶活力存在差異[34]，3種顏色刺參（Apostichopus japonicus Selenka）在不同光照強度下的免疫酶活性存在差異[35]，另外鑒于該試驗引進的“鲆優(yōu)2號”幼苗無眼側黑化情況較為普遍，對照普通苗中存在一定比例的黑化和正常苗;對不同體色牙鲆之間的免疫學指標進行了比較，結果表明牙鲆的抗病力與無眼側黑化與否的關聯(lián)性不顯著。

3.5 運輸應激對牙鲆免疫力的影響

在活魚運輸過程中水體污染、振動、密度過高、溫度變化、運輸時間過長等因素均會不同程度引發(fā)魚體應激，進而影響機體功能[36]。宋凱等[37]對牙鲆的研究表明運輸將打破魚體的內分泌平衡，使其機體內產生氧化應激。該試驗結果表明，相同背景、經歷運輸（未產生休克）與未經歷運輸樣本魚的6種免疫學指標差異不顯著，究其原因可能是由于機體受到應激脅迫后，首先進行一級、二級反應，嚴重時才導致三級反應，即免疫系統(tǒng)受到抑制等[38-39]，上述6種免疫學指標在機體內參與應激反應的時間相對滯后。

4 結論

綜上所述，通過一定的育種手段可使新品種牙鲆獲得一定的免疫優(yōu)勢;隨著牙鲆個體的生長，體重增加，抗病力顯著增強;牙鲆的抗病性能與黑化與否的關聯(lián)性不顯著;經過運輸（未產生休克）與未經過運輸樣本魚的6種免疫學指標差異不顯著。該試驗結果表明定向育種操作、體重、休克均可對牙鲆某種或某幾種免疫學指標產生影響，無眼側有無黑化、適度的運輸操作對該試驗中牙鲆6種免疫學指標的影響不顯著。

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