摘要：采用回流提取法提取羅漢松[ Podocarpus macrophyllus（ Thunb.）D.Don]葉總黃酮，通過單因素試驗，考察提取方法、提取溶劑體積分數(shù)、提取體積、提取時間對藥材總黃酮含量的影響，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，篩選出羅漢松葉總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，羅漢松葉總黃酮的最佳提取工藝為75%乙醇、料液比1：30（g： mL）、回流提取時間0.5 h。該方法重復性較好、穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞：羅漢松[ PodocarpMs macrophyllus（ Thunb.）D.Don];葉;總黃酮;提取工藝;紫外可見一分光光度法

中圖分類號：R282

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 20-0141-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.032

羅漢松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.）D.Don]又名土杉，是羅漢松科羅漢松屬植物，主要分布在中國的廣西、貴州、江蘇、廣東、湖南等地[1，2]。據(jù)《中藥志》記載，羅漢松性平、味淡，含有黃酮類、揮發(fā)油、萜類化合物等成分，臨床上具有補中益氣、祛風除濕、涼血止血等功效，用于治療關(guān)節(jié)腫痛、心胃氣痛、咳血吐血等疾病[3]。現(xiàn)代科學研究表明[4-9]，黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗病原微生物活性、改善心肌供血等作用[10]，還具有抗腫瘤、抗心血管疾病、糖尿病、抗感染和抗病毒等藥理作用[11-17]。此外，羅漢松內(nèi)生的真菌對寄主植物的病蟲害具有一定的防御作用[18- 19]。目前，國內(nèi)對羅漢松葉中總黃酮含量測定的相關(guān)研究較少，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，本研究對12批不同產(chǎn)地的羅漢松葉進行總黃酮含量的測定，采用單因素試驗考察了提取方法、提取溶劑體積分數(shù)、提取體積、提取時間對提取羅漢松藥材葉總黃酮含量的影響，再采用正交試驗進一步優(yōu)選最佳提取工藝，為研究羅漢松藥材的質(zhì)量標準提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試羅漢松藥材來源見表1，采集部位均為葉片，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室梁子寧教授鑒定為羅漢松，經(jīng)55℃烘干，備用。蘆?。ㄅ枺?75125），純度>98%，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;其余試驗所用試劑均為分析純。

1.2儀器

島津UV1780型紫外一可見分光光度計;法國默克密理博Milli-Q Integral超純水儀（蘇州賽恩斯儀器有限公司）;XS105D型十萬分之一天平（梅特勒一托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司）;KQ5200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;DFT-IOOO高速萬能打粉機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.3方法

1.3.1 對照品溶液的制備精密稱取105℃干燥恒重的蘆丁對照品6.25 mg，加75%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.25mg/mL的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備精密稱取藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加75%乙醇30 mL稱定重量，回流提取0.5 h，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取過濾液1 mL置25 mL量瓶中，即得樣品溶液。

1.3.3 線性方程的制定分別取“1.3.1”的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在510nm處測定吸光度[20]。以吸光度對濃度作圖，得到線性方程為y= 8.695 2x-0.005 4.R2 =0.999 1，在0.012 5-0.100 0 mg/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，蘆丁線性方程見圖1。

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度試驗精密稱取廣西賀州市產(chǎn)的羅漢松藥材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測定。于510 nm波長處連續(xù)6次測定其吸光度，結(jié)果RSD為2.18%，該方法精密度良好。

1.4.2穩(wěn)定性試驗精密稱取廣西賀州市產(chǎn)的羅漢松藥材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色，于510 nm波長處分別在0、20、40、60、80、100、120 min測定同一供試液在不同時間下的吸光度，計算藥材的RSD為2.92%。結(jié)果表明，藥材的吸光度在120 min內(nèi)基本不變，可見藥材樣品在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.3重復性試驗精密稱取廣西賀州市產(chǎn)的羅漢松藥材樣品6份，每份藥材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法于510 nm波長處平行測定其吸光度，計算羅漢松藥材葉的平均總黃酮含量為32.40 mg/g，RSD為2.88%，表明該方法重復性良好。

1.4.4加樣回收率試驗精密稱稱取羅漢松莖藥材粉末6份，每份0.5g，加入蘆丁對照品16.2 mg，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法于510 nm波長處平行測定其吸光度，計算總黃酮的含量。由結(jié)果可知，平均回收率為99.25%，RSD為2.91%（n=6），表明該方法回收率良好（表2）。

1.5 單因素試驗

1.5.1 提取方法的考察精密稱取廣西賀州市產(chǎn)的羅漢松藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，以提取時間1.0 h，30 mL 75%乙醇為提取條件，分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對藥材進行總黃酮的提取，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測定其吸光度。

1.5.2提取溶劑體積分數(shù)的考察精密稱取羅漢松藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，以提取時間1.0 h、30 mL不同體積分數(shù)的乙醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，以乙醇溶劑不同體積分數(shù)對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，設計乙醇體積分數(shù)分別為35%、45%、55%、65%、75%和85%，測定其吸光度。

1.5.3 提取時間的考察精密稱取羅漢松藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，以30 mL 75%乙醇為提取條件，采用回流提取法，以提取時間對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，設提取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，測定其吸光度。

1.5.4提取體積的考察精密稱取羅漢松藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，提取時間1.0 h，以75%乙醇為提取條件，采用回流提取法，以75%乙醇不同體積對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，設計75%乙醇提取體積為分別10、20、30、40、50、60 mL，測定其吸光度。

1.6 正交試驗

從羅漢松葉中提取藥材總黃酮的方法主要為有機溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻[3，20-22]和參考《中國藥典》（2015年版），本試驗采取不同乙醇為溶劑的提取方法，根據(jù)單因素考察結(jié)果分析，設置乙醇體積分數(shù)、料液比（g：mL，下同）、提取時間這3個條件。根據(jù)正交設計助手軟件，選用/g（ 34）正交試驗設計（表3）。精密稱取羅漢松葉藥材粉末1.0 g，測定羅漢松葉中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1提取方法對羅漢松藥材葉總黃酮提取率的影響 由圖2可知，采用回流提取法，羅漢松藥材葉中總黃酮提取率最高，故而選擇回流提取法進行后續(xù)試驗。

2.1.2提取溶劑體積分數(shù)對羅漢松藥材葉總黃酮提取率的影響 由圖3可知，采用回流提取法，以75%乙醇提取羅漢松藥材葉中總黃酮，得到的提取率最高。

2.1.3提取時間對羅漢松藥材葉總黃酮提取率的影響 由圖4可知，分析了不同提取時間對羅漢松藥材葉中總黃酮提取率的影響，提取時間為1.0 h時，總黃酮提取率最高。

2.1.4提取體積對羅漢松藥材葉總黃酮提取率的影響 由圖5可知，當提取體積為30 mL時，羅漢松藥材葉中總黃酮的提取率最高。

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)正交設計助手軟件，試驗方差分析結(jié)果可知，以羅漢松葉中總黃酮含量為指標，由于各試驗因素對羅漢松葉中總黃酮提取效果的影響程度不同。正交試驗結(jié)果和方差分析（表4、表5）表明，乙醇體積分數(shù)和料液比對羅漢松葉中總黃酮的提取工藝有顯著影響，而提取時間無顯著影響，且各影響因素的強弱為乙醇體積分數(shù)（A）>料液比（B）>提取時間（C）?？紤]試驗效率和時間，故而選擇提取時間為0.5 h，因此，本試驗最理想的提取方案是A282C，，即乙醇體積分數(shù)是75%，料液比是1：30，回流提取時間是0.5 h，此條件下提取效果最佳。

2.3 樣品含量測定

精密稱取每個產(chǎn)地的羅漢松藥材粉末3份，每份約1.0 g，置于錐形瓶中，按照正交試驗得到的最佳工藝條件測定各材料的總黃酮含量，藥材1-12的總黃酮含量分別為37.09、36.83、38.24、37.31、36.74、32.06、36.18、35.42、36.41、35.35、36.19、35.08mg/g。

3 小結(jié)與討論

以羅漢松葉為研究對象，考察了乙醇體積分數(shù)、提取體積和提取時間3個影響因素，采用回流提取法來提取羅漢松葉總黃酮，利用正交試驗的方法優(yōu)選了羅漢松葉總黃酮的最佳提取工藝。根據(jù)相關(guān)文獻，確定影響羅漢松葉總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑濃度、提取體積和提取時間等，根據(jù)影響因素的選擇，采用L0（ 34）正交試驗，并進行多次驗證試驗，結(jié)果表明，羅漢松葉的最佳提取工藝為采用回流提取法，乙醇體積分數(shù)75%，料液比1：30，提取時間0.5 h，此工藝條件下提取效果最佳，數(shù)據(jù)可靠。

在相同試驗條件下，加入等量相同體積分數(shù)的乙醇可能會出現(xiàn)提取效率不一致的狀況。具體原因可能是由于羅漢松藥材粉末接觸乙醇的溶劑面積不一樣。但是在加入相同質(zhì)量的羅漢松葉的情況下，加入乙醇的量越多，對提取的效率有正相關(guān)關(guān)系。除此之外，還可以考察更多的試驗因素，比如提取溫度、提取溶劑、溶劑pH和提取次數(shù)等，并且每個因素也可以通過單因素考察的方法確定出試驗水平，再通過正交設計試驗優(yōu)選出提取率更佳的試驗方案。

不同產(chǎn)地羅漢松葉中總黃酮含量差異較大，廣西北海市的羅漢松葉總黃酮含量最高，其次是廣西靖西市和廣西玉林市，而廣西貴港市的羅漢松葉總黃酮含量最低。不同產(chǎn)地羅漢松葉總黃酮的含量差異，可能是由于不同地域、不同氣候、不同土壤以及不同的采摘季節(jié)影響而產(chǎn)生的結(jié)果。

羅漢松自然資源豐富，在臨床應用中廣泛使用。目前，對羅漢松葉總黃酮的研究還較少，為保障其臨床合理用藥、安全、有效，本研究通過正交試驗篩選出羅漢松葉總黃酮的最佳提取工藝，為進一步研究、開發(fā)羅漢松的藥用資源提供了科學依據(jù)。

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作者簡介：劉睿（1983-），女，廣西賀州人，主管中藥師，主要從事中藥學的相關(guān)研究，（電話）18177479182（電子信箱）157742387@qq.cm;通信作者，陳朝（1980-），副主任藥師，碩士，主要從事醫(yī)院藥學與中藥制劑研發(fā)，（電子信箱）32605734@qq.com。