余海軍 王乙婷 黃鑫 邰春青 鄭慧芳 王茜

摘要：基于DNA條形碼和形態(tài)學對雷公山自然保護區(qū)的搖蚊類群進行物種鑒定。結果表明，自然保護區(qū)內(nèi)的搖蚊類群共計4亞科12屬18種，并對其中的12屬特征進行補充描述，附18種搖蚊成蟲的整體標本圖;通過DNA條形碼分析得到18個mOTU（ Molecular operational taxonomic unit），與形態(tài)學結果一致。

關鍵詞：搖蚊科;DNA條形碼;物種鑒定;雷公山自然保護區(qū)

中圖分類號：S931.1

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114[ 2020） 20-0083-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.20.018

雷公山自然保護區(qū)（國家級保護區(qū)）位于貴州省東南部，地跨雷山、臺江、劍河、榕江四縣，面積達47 300 hm2。雷公山自然保護區(qū)屬于長江水系和珠江水系的分水嶺地帶，是構成清水江和都柳江主要支流的發(fā)源地…。自然保護區(qū)由于氣候溫暖，生境復雜，為昆蟲物種提供了優(yōu)良的棲息環(huán)境，從而保護區(qū)內(nèi)的昆蟲物種資源一直較為豐富。2011年的研究調查顯示，雷公山自然保護區(qū)昆蟲有22目194科1 114屬1 861種，其中，雙翅目14科89屬261種[2]。

搖蚊（ Chironomidae）隸屬于雙翅目長角亞目（ Diptera：Nematocera），全世界已記述的種類超過6 359種[3]。搖蚊廣布于各種水體中，是種類最多、分布最廣的淡水底棲動物類群之一[4];由于搖蚊的遷移能力相對較弱，不同種屬之間的生態(tài)要求和生活習性多種多樣，不同類群對生存環(huán)境適應變化有較大的差異，從而使得它們成為水環(huán)境生物監(jiān)測的優(yōu)良指示物。

截至2001年，國內(nèi)有關搖蚊研究的論文達200余篇[5]。DNA條形碼問世后[6]，學者將其結合傳統(tǒng)形態(tài)學廣泛用于搖蚊的研究，取得了較大的成果，特別是在江浙一帶，關于搖蚊研究的報道層出不窮[7-13]。雷公山自然保護區(qū)的地質結構復雜，巖石層中富含獨特的化學物質和生命營養(yǎng)物質，是生命科學和地球科學之間微觀聯(lián)系的地區(qū)[2]。李小海等[14]2014年在雷公山自然保護區(qū)發(fā)現(xiàn)昆蟲3種新紀錄種，即鱗翅目1種，鞘翅目2種;付梓源等[15]2015年通過對雷公山自然保護區(qū)進行生物調查，記述昆蟲15種，即半翅目1種，鱗翅目4種，鞘翅目10種;但迄今為止，該地區(qū)關于雙翅目的報道，尤其是搖蚊物種的報道較為鮮見。本研究通過DNA條形碼和形態(tài)學對自然保護區(qū)內(nèi)的搖蚊進行研究，目的是為中國DNA條形碼數(shù)據(jù)庫提供有效數(shù)據(jù)，以及提供基礎數(shù)據(jù)用于今后雷公山自然保護區(qū)的生態(tài)環(huán)境研究和生物多樣性評估。

1 材料與方法

1.1 標本制作及鑒定

所用標本均來自于2019年8月21日至10月7日貴州省黔東南州雷山縣雷公山自然保護區(qū)。樣本保存于85%乙醇，標本照片采用智能數(shù)字立體解剖鏡進行整體照。并在體視鏡下解剖為頭、胸、足、翅、腹部5個部分，頭、胸部留取用作DNA提取，其余部分用Eurpal樹膠封片，DNA提取后頭、胸部相繼封存于相應的玻片上作為證據(jù)標本。形態(tài)鑒定特征術語采用文獻[16]的描述方法，特征的測量參考李麗梅[17]的研究方法;證據(jù)標本均保存于天津農(nóng)學院水產(chǎn)遺傳育種實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

基因組DNA提取采用Qiagen DNA Blood andTissue kit試劑盒，并按照試劑盒說明書提取。使用通用引物LC01490和HC02198[18]擴增COI條形碼。PCR擴增反應體系為25.000 μL.包含12.500 μL 2xEs Taq MasterMix（ CoWin Biotech Co， Beijing， China），上、下游引物各0.625 μL，無菌水8.750 μL，DNA模板2.500 μL。通過Mastercycler Gradient進行擴增，擴增程序為：預變性98℃10 s，94℃5 min;94℃1 min，51℃1 rriin.72℃1 min，35個循環(huán);最后延伸72℃5 min;10℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行純化測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測序公司返回的序列導人Seqman（ DNA-STAR，Madison，USA）中進行編輯[7]。序列通過MEGA 7.0軟件使用MUSCLE算法進行比對，并對序列特征及各堿基含量進行統(tǒng)計;使用Kimura-2-parameter （K2P）堿基替換模型計算各序列之間的遺傳距離;選用K2P堿基進化模型，節(jié)點處置信度為1 000，其他設置均為默認值，建立NJ （Neighbor-joining）樹。

2 結果與分析

2.1 DNA條形碼分析結果

采用DNA條形碼分析中最常用的NJ法，該法基于遺傳距離和最小進化原理，通過自舉檢驗法進行聚類，并通過統(tǒng)計給定樹分支的可信度，得出最優(yōu)樹[19]。在NJ樹中，基于27條DNA條形碼明顯分離出18個mOTU，代表搖蚊科中已命名的物種，該結果顯示DNA條形碼的鑒別結果與形態(tài)學鑒定結果一致，如圖1所示。同時，研究所用的27條DNA序列及其相關信息均已上傳Barcode of Life Data System（ BOID，http：//www. boldsystems.org）數(shù)據(jù)庫的公開Project“HJB”。

2.2保護區(qū)搖蚊種類記述

本研究記述雷公山自然保護區(qū)搖蚊物種共4亞科12屬18種，基于Wiederholm[20]對搖蚊科物種形態(tài)學的描述，對其中12屬的主要特征進行補充描述，并提供18種的標本整體照。

2.2.1 搖蚊亞科（Chironominae） Macquart

1）搖蚊屬（Chironomus Meigen）。主要特征：體型中到大型。體色綠或淡棕黃色，觸角11節(jié)，觸角比（AR）遠大于2.0;翅膜質部分沒有剛毛，有明顯刻點，花翅搖蚊（Chironomus kiiensis）翅上有明顯的翅斑，臀角具剛毛，R、R1、R4+5有剛毛，腋瓣具有緣毛。中后足脛節(jié)具有排列緊密的脛櫛，有強壯的脛距，偽脛距存在或者缺失。腹部背板有分散或密集的剛毛。肛尖端部膨大;上附器細長，末端鉤狀;下附器棒狀，末端靠近抱器端節(jié)中部。

世界廣布，中國記錄24種，本研究記述2種，分別為黃羽搖蚊（Chironomusflaviplumus）（圖2A）、花翅搖蚊（圖2B）。

2）多足搖蚊屬（Polypedilum Kieffer）。主要特征：體小型到大型。體色淡黃、棕黃或黑色，翅具翅斑或呈褐色，足有時具各種黑色環(huán)。觸角鞭節(jié)13節(jié)，觸角比0.60-3.50;R、R1、R4+5有剛毛。肛尖細長。上附器細長多變，基部具長毛和微毛;中附器缺失;下附器棒狀，抱器端節(jié)形狀和長度多變，與抱器基節(jié)相連處窄。

世界廣布，中國記錄62種，本研究記述6種，分別為源平多足搖蚊（Polypedilum genpeiense）（圖2C）、淺川多足搖蚊（Polypedilum asakawaense（圖2D）、加茂三多足搖蚊（Polypedilum kamotertium）（圖2E）、陽山多足搖蚊（Polypedilum yougsanensis）（圖2F）、仙居多足搖蚊（Polypedilum xianjuensis）（圖2G）、刀鋏多足搖蚊（Polypedilum cultellatum）（圖2H）。

3）擬搖蚊屬（Parachironomus Lenz）。主要特征：體中到大型，翅長2.00-4.50 mm;體黃或棕色，色斑棕色或黑色，部分種類足和腹部具色帶。觸角11節(jié)，觸角比1.50-3.30。翅膜區(qū)無毛，少數(shù)具頂剛毛，腋瓣具較多緣毛。生殖節(jié)第九背板后緣形態(tài)多變，鍥形，圓形，或明顯形成側翼。肛尖細長;上附器長短不一，頂端常具喙狀側突，端部具剛毛，生于凹陷處;下附器葉狀突起有時退化。抱器端節(jié)與基節(jié)愈合，形狀多樣。

世界廣布，中國記錄13種，本研究記述1種，為細突擬搖蚊（Parachironomus exilisus）（圖21）。

4）明搖蚊屬（Phaenopsectra Kieffer）。主要特征：體中到大型，翅長2.08-3.00 mm;體棕色;足淺黃色;觸角13節(jié)，觸角比1.00-3.00;翅膜區(qū)具斑點和少量剛毛，腋瓣具短緣毛;生殖節(jié)第IX背板中部具剛毛;肛尖細長，端部略膨大;上附器細長，端部鉤狀，基部具剛毛;下附器指狀或棒狀，常密布剛毛，端部常具長剛毛;無中附器;抱器端節(jié)細長，形態(tài)多變，常呈棒狀。

本研究記述1種，為黃明搖蚊（Phaenopsectraflavipes）（圖2J）。

5）薩博搖蚊屬（Sublettea Roback）。主要特征：體小型，翅長1.07 mm;體黃色，足淺黃色;觸角13節(jié)，觸角比0.36;生殖節(jié)肛尖無刺狀突起，中附器葉狀，上附器端部收縮，指附器長且彎曲。

本研究記述1種，為威爾薩博搖蚊（Subletteawilesi）（圖2K）。

6）長跗搖蚊屬（Tanytarsus van der Wulp）。主要特征：觸角13節(jié)，觸角比0.17 -2.20。部分種類腹部具色帶。翅膜區(qū)密被剛毛;R1翅室末端部分、R4+5脈和M1+2脈具剛毛，Cu脈無剛毛。生殖節(jié)第九背板帶中部分離，愈合成Y形或末端于肛尖基部愈合;肛尖有或無肛脊，肛脊之間常具小棘刺;上附器形狀多樣，下附器直或細而彎曲;中附器存在，呈葉狀。

世界廣布，中國記錄約40種，本研究記述1種，為臺灣長跗搖蚊（Tanytarsus formosanus）（圖2L）。

7）夏搖蚊屬（Xiaomyia Sc-ether&Wang）。主要特征：體小型，翅長1.17-1.44 mm;體黃，腹部具藍色帶。觸角13節(jié)，觸角比0.81-0.83。所有足均具單脛距，無脛櫛。生殖節(jié)抱器端節(jié)具齒，并可以轉動，抱器基節(jié)與下附器愈合。

中國記錄1種，本研究記述1種，為似足夏搖蚊（Xiaomyia aequipedes）（圖2M）。

2.2.2寡角搖蚊亞科（Diamesinae） 波搖蚊屬（Pot-thastia Kieffer）。主要特征：體中型，觸角13節(jié)，體棕黃，足淺黃色并具少量色斑，觸角比1.50-2.50。翅表面缺少剛毛，斑點色淺;前緣脈稍伸長，R2+3脈明顯，R4+5脈無剛毛。生殖節(jié)肛尖小，上有或無剛毛;抱器端節(jié)上存在較長的抱器端棘。

中國記錄3種，本研究記述1種，為雙角波搖蚊（Potthastia montium）（圖20）。

2.2.3 直突搖蚊亞科（Orthocladiinae）

1）環(huán)足搖蚊屬（Cricotopus van der Wulp）。主要特征：體型不等，小型至大型，翅長4.00 mni。足和背板通常有色斑間隔及明亮顏色的色環(huán)。觸角13節(jié)，觸角比0.30-2.10。翅膜區(qū)無剛毛，腋瓣具緣毛。足具色環(huán)，中足、后足極少具l根脛距，偽脛距缺失。生殖節(jié)肛尖常缺失;如果存在非常小，背板側毛退化;上附器扁平、圓狀或駝峰狀;下附器形態(tài)多樣，葉狀或被腹葉成對;抱器端節(jié)簡化，亞端背脊窄并在頂端具剛毛，抱器端棘存在或缺失。

世界廣布，中國記錄18種，本研究記述1種，為三束環(huán)足搖蚊（Cricotopus trifascia）（圖2P]。

2）中足搖蚊屬（Metriocnemus van der Wulp）。主要特征：體小到中型，翅長1.50-1.83 mm。體淡黃色或棕黑。觸角13節(jié)，觸角比0.80-1.50。翅膜區(qū)通常密具剛毛或具有細小至粗糙的刻點，臀角中部十分發(fā)達，R脈有毛，腋瓣具緣毛。生殖節(jié)肛尖細長，由基部到頂端逐漸變細尖，第九背板有或者沒有毛，抱器基節(jié)具有發(fā)達或明顯退化的下附器，有的為瓣狀下附器;抱器端節(jié)細長，具有小、尖三角形亞端背棘，或者亞端背棘不發(fā)達。

中國記錄6種，本研究記述1種，為一線中足搖蚊（Metriocnemus unilinearis）（圖2Q）。

2.2.4 長足搖蚊亞科（Tanypodinae）

1）無突搖蚊屬（Ablabesmyia Johannsen）。主要特征：體小到中型，翅長1.38-4.00 mm。體棕黃色，足具色帶。觸角13節(jié)，觸角比1.25-3.60。有些種類翅膜區(qū)有剛毛，翅上有明顯的翅斑。抱器基節(jié)基部輕微膨大，并向端部逐漸變窄，有明顯的背部剛毛和內(nèi)側的剛毛簇;抱器端棘耳狀，末端變寬或有亞端部剛毛存在;上附器直或微彎曲，末端圓或尖;中附器多數(shù)比上附器短;下附器退化成一個小突起。

中國記錄16種，本研究記述1種，為前桅無突搖蚊（Ablabesmyia prorasha）（圖2R）。

2）前突搖蚊屬（Procladius Skuse）。主要特征：體小到中型，翅長1.30-4.20 mm。體棕或黑色，腹部有明顯的色斑帶。觸角13節(jié)，觸角比1.34-2.90。翅膜區(qū)有或無被毛，偶具翅斑;前緣脈超過R4+5脈很多，到達翅的頂端;MCu脈位于FCu脈前端;R2+3脈存在，并分叉，腋瓣具緣毛，臀角發(fā)達。生殖節(jié)肛尖寬，端部圓鈍;抱器基節(jié)基部寬，端部1/2處逐漸變窄;下附器多毛，明顯或不明顯或缺失;抱器端節(jié)粗壯或細長;抱器端棘短且粗。

中國記錄9種，本研究記述1種，為黑前突搖蚊（Procladius nigriventris）（圖2S）。

3 小結

本研究采集中國貴州省黔東南州雷山縣雷公山自然保護區(qū)的搖蚊昆蟲4亞科12屬18種，共計27個樣本?；谛螒B(tài)學對12屬的特征進行補充描述，并提供18種搖蚊成蟲的整體標本;在此基礎上使用DNA條形碼技術對27個樣本進行分子鑒定，NJ樹的結果顯示，數(shù)據(jù)集分離出18個mOTU，與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定一致，為進一步證明DNA條形碼能準確鑒別搖蚊科昆蟲提供數(shù)據(jù)支持。本研究的數(shù)據(jù)均已上傳中國DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，在豐富中國搖蚊科數(shù)據(jù)庫的同時，也為雷公山自然保護區(qū)的生態(tài)環(huán)境研究和生物多樣性評估提供基礎數(shù)據(jù)。

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作者簡介：余海軍（1994-），男，貴州雷山人，在讀碩士研究生，主要從事分子系統(tǒng)學研究，（電話）18322040463（電子信箱）yhjl8322040463@163.com;通信作者，王茜（1971-），（電話）13682014584（電子信箱）wqgt1999@163.com。