唐建民 齊力旺 賀小婷 蔣雨欣 李哲馨

摘 要：生姜（Zingiber officinale Roscoe）是藥食兼用的高附加值特色經(jīng)濟作物，姜辣素是生姜的核心藥用成分，6-姜酚則是姜辣素的主要成分。以川渝特色生姜品種竹根姜根莖為研究材料，克隆ZoWRKY1基因并分析其在竹根姜不同發(fā)育階段的表達及其與6-姜酚含量增量的相關(guān)性，探討不同濃度NaCl脅迫下ZoWRKY1與6-姜酚合成酶基因ZoPAL、ZoC4H和Zo4CL的表達及其相關(guān)性。結(jié)果表明：克隆的ZoWRKY1基因cDNA全長1 026 bp， 登錄號為MT414710;氨基酸序列分析顯示ZoWRKY1屬于WRKY家族的第二類成員;ZoWRKY1的表達水平在竹根姜發(fā)育的第二階段即播種后1個月左右高度上調(diào)，且與6-姜酚含量增量存在顯著的相關(guān)性;在25 g/L NaCl脅迫下，ZoWRKY1與6-姜酚合成酶基因ZoPAL、ZoC4H和Zo4CL高度上調(diào)表達，且ZoWRKY1與ZoC4H和Zo4CL的表達存在顯著相關(guān)性，推測ZoWRKY1基因與ZoC4H及Zo4CL基因存在調(diào)控關(guān)系并進一步影響6-姜酚的生物合成。

關(guān)鍵詞：生姜;WRKY轉(zhuǎn)錄因子;6-姜酚合成;相關(guān)性

中圖分類號：Q786 文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2020）10-0001-05

Abstract： Ginger （Zingiber officinale Rosc.） is a special economic crop with high added value for both medicine and food. Pungent prinsiple is the core medicinal component of ginger， and 6-gingerol is the main component of pungent prinsiple. ZoWRKY1 gene was cloned from rhizomes of Zhugen Ginger in Sichuan and Chongqing. The expression of ZoWRKY1 gene in different developmental stages and its correlation with 6-gingerol content increment were analyzed. The expression and correlation of ZoWRKY1 and 6-gingerol synthase genes ZoPAL， ZoC4H and Zo4CL under different concentrations of NaCl stress were investigated. The results showed that the full length cDNA of ZoWRKY1 gene was 1026 bp and the accession number was MT414710; amino acid sequence analysis showed that ZoWRKY1 belonged to the second class member of WRKY family; the expression level of ZoWRKY1 was highly up-regulated in the second stage of Zhugen Ginger development about one month after sowing， and there was a significant correlation between ZoWRKY1 expression and 6-gingerol content increment; under 25 g/L NaCl stress， the expression of ZoWRKY1 and 6-gingerol synthetase genes ZoPAL， ZoC4H and Zo4CL?were highly up-regulated， and the expression of ZoWRKY1was significantly correlated with the expression of ZoC4H and Zo4CL. It is speculated?that there is a regulatory relationship between ZoWRKY1and ZoC4H and Zo4CL genes， and further affect the biosynthesis of 6-gingerol.

Key words： ginger （Zingiber officinale Rosc.）; WRKY transcription factor; 6-gingerol synthesis; correlation

生姜（Zingiber officinale Rosc.）是姜科（Zingiber-aceae）姜屬（Zingiber）多年生宿根草本單子葉植物，也是藥食兩用的經(jīng)濟作物。姜辣素（pungent prinsiple）是生姜中的辛辣味物質(zhì)和藥用核心成分[1-4]。姜酚類（gingerols）物質(zhì)是姜辣素的主要成分，尤以6-姜酚含量最高，可達姜辣素含量的75% 以上。含有苯丙烷結(jié)構(gòu)的物質(zhì)都是通過苯丙烷代謝途徑直接或者間接生成的。目前在已知的包括6-姜酚在內(nèi)的含有苯丙烷結(jié)構(gòu)的物質(zhì)生物合成通路中，苯丙氨酸氨裂解酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate：CoA ligase，4CL）等酶在6-姜酚的合成過程中扮演著重要角色[5-6]。大量試驗數(shù)據(jù)表明這些酶基因控制著苯丙烷類代謝物的合成。在阿月渾子和銀杏樹中，PAL基因的表達量與黃酮含量均表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系[7-8]。通過脅迫處理降低菊花C4H基因表達量，也會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)量的減少[9]。桉樹中下調(diào)C4H的表達會導(dǎo)致木質(zhì)素含量減少18.9%[10]。在短莛飛蓬和凹唇姜中，4CL基因的表達水平與黃酮類物質(zhì)的積累呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性[11-12]。在煙草或擬南芥中抑制PAL、C4H、4CL的表達，均會導(dǎo)致木質(zhì)素含量的降低，并造成木質(zhì)素構(gòu)成的改變[13]。將C4H反義基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，基因沉默植株木質(zhì)素含量均有不同程度的降低[14]。

植物中誘導(dǎo)型基因的表達主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，而在轉(zhuǎn)錄水平上起主要作用的是各類轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物木質(zhì)素、黃酮類等苯丙烷類物質(zhì)合成過程中起著重要的調(diào)控作用。歐洲葡萄VvWRKY2基因可激活木質(zhì)素生物合成途徑中VvC4H的表達，進而調(diào)控木質(zhì)素的合成與積累，這一功能在煙草中獲得驗證[15]。在毛白楊PtrWRKY25超量表達的轉(zhuǎn)基因株系中木質(zhì)素含量相較于野生型減少約1倍，表明PtrWRKY25可能主要在木質(zhì)素合成途徑中發(fā)揮作用[16]。其他植物如苜蓿、云杉等也有WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控木質(zhì)素合成的相關(guān)報道[17-18]。擬南芥中，AtWRKY23能通過上調(diào)編碼黃酮生物合成途徑相關(guān)酶基因的表達來刺激黃酮類生物合成，且該調(diào)控機制與生長素信號途徑密切相關(guān)[19]。葡萄中篩選的VvWRKY26轉(zhuǎn)錄因子在花青素合成中具有重要的調(diào)控作用[20]。過表達苜蓿MdWRKY11基因可促進F3H、FLS、DFR、ANS和UFGT的表達，進而導(dǎo)致蘋果愈傷組織中黃酮和花青素的積累量增加[21]。

植物在與環(huán)境相互作用時獲得了一系列的防衛(wèi)反應(yīng)機制，在應(yīng)對外界各種生物和非生物的脅迫時，植物能通過體內(nèi)抗性基因的表達，合成并積累次生代謝產(chǎn)物來抵御逆境脅迫以減輕傷害[22]。根據(jù)前期已經(jīng)獲得的竹根姜肉質(zhì)根、地下根莖、地上莖及葉片的RNA-seq測序結(jié)果[23]，篩選到23個WRKY基因（ZoWRKY），按順序編號為1～23，其中有5個ZoWRKY（命名為ZoWRKY1～ZoWRKY5）在地下根莖中高度表達。其中ZoWRKY1 基因被鹽脅迫誘導(dǎo)后表達量變化較大。該研究重點對ZoWRKY1進行克隆與生物信息學(xué)分析，探索其在竹根姜發(fā)育不同階段以及不同濃度鹽脅迫下的表達，并結(jié)合6-姜酚含量及其生物合成關(guān)鍵酶基因的表達量分析，闡釋 ZoWRKY1與6-姜酚合成可能存在的調(diào)控關(guān)系，以期為ZoWRKY1在生姜6-姜酚生物合成調(diào)控中的功能研究奠定基礎(chǔ)，并為實現(xiàn)植物化學(xué)物質(zhì)合成與積累的人工調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采集

選取川渝特色生姜品種竹根姜[24] “渝姜1號”作為研究材料，每年4月開始種植母姜（催芽1個月），10月采收。 根據(jù)不同的研究內(nèi)容分別采樣。（1）不同發(fā)育階段竹根姜樣品采集：每月15日采集第一分支子姜根莖材料，4月15日—9月15日共6個階段，記為stage 1～stage 6。（2）NaCl脅迫下竹根姜樣品采集：對播種一個月的竹根姜植株葉片噴施不同濃度NaCl溶液（濃度分別為0、25、50、75、100和125 g/L）[25]，2 d噴施一次，第10天收獲地下根莖。上述樣品采集后均置于液氮中快速冷凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA合成

樣品總RNA提取采用RNAiso Plus Total RNA 提取試劑盒（Takara，大連），瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示各階段樣品28S和 18S RNA 清晰可見且無降解，利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒（TransGen，北京）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 基因克隆與序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計ZoWRKY1基因序列的特異引物（表 1），以不同發(fā)育階段竹根姜混合cDNA為模板進行 PCR 擴增，反應(yīng)體系（20 μL）：0×Buffer?10 μL、1.5 mmol/ L Mg2+ 1.5 μL、0.1 mmol/ L dNTPs 4 μL、0.4 μmol/ L F、R引物各0.5 μL、0.5 U rTaq DNA 聚合酶0.2 μL、200 ng/μL cDNA 模板1 μL、ddH2O 2.3 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序：95℃ 5 min;95℃ 10 s，56℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72℃ 7 min。PCR擴增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物條帶單一，切膠回收后連接至克隆載體，克隆試劑盒選用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，篩選陽性克隆，對菌液進行PCR檢測和測序驗證。采用DNAman軟件分析ZoWRKY1序列組分，并采用在線工具http：//smart.embl-heidelberg.de/預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)。

1.4 qRT-PCR分析

將不同發(fā)育階段及NaCl脅迫處理的竹根姜根莖組織cDNA分別稀釋10倍作為反應(yīng)模板，采用TB GreenTM Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara，大連）在qTOWER2.0實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Analytik Jena，德國）進行qRT-PCR檢測與分析。引物序列如表1所示。反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 2 μL、TB Green Ⅱ 10 μL、引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s;95℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.5 相關(guān)性分析

前期采用LC-MS技術(shù)測得不同發(fā)育階段竹根姜中6-姜酚的含量。6-姜酚各階段增量為各階段6-姜酚總量減去其前一階段6-姜酚總量。采用IBM SPSS Statistics18.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜ZoWRKY1基因的克隆與序列分析

從竹根姜轉(zhuǎn)錄組測序文庫中獲得ZoWRKY1 基因的 cDNA 序列，在NCBI中進行BLASTx比對及 ORF 分析，顯示該序列具有完整的ORF，推測其為全長基因。設(shè)計其特異性引物，以不同發(fā)育階段竹根姜根莖組織混合cDNA 為模板，進行 PCR 擴增，產(chǎn)物與預(yù)期大小相符（圖1A）。將 PCR 產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體上， 測序后獲得竹根姜ZoWRKY1基因的cDNA序列，全長1 026 bp， 利用DNAman軟件對ZoWRKY1基因序列進行分析，結(jié)果顯示其編碼的蛋白質(zhì)由341個氨基酸組成。ZoWRKY1基因 cDNA 的序列信息已提交到 NCBI Genbank，登錄號為MT414710。經(jīng)NCBI比對，該基因與姜目芭蕉科小果野蕉MdWRKY21（XM_018829735）的同源性高達92%。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，ZoWRKY1含有1個 WRKY保守結(jié)構(gòu)域以及2個LCR（low complexity region）區(qū)域，并包含有C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)（圖1B和 C），說明ZoWRKY1屬于WRKY家族的第二類成員。

2.2 ZoWRKY1在生姜不同發(fā)育階段的表達

采用qRT-PCR技術(shù)檢測了竹根姜不同發(fā)育階段ZoWRKY1基因的表達水平，結(jié)果如圖2所示，ZoWRKY1基因的表達在竹根姜發(fā)育過程中變化明顯，竹根姜早期發(fā)育階段，即催芽播種后1～2個月（對應(yīng)stage 2—3）時表達量驟然上升，較播種時增加了5倍之多;隨后幾個月的表達水平則大幅下降，與剛播種時差異不明顯。

2.3 ZoWRKY1表達量與6-姜酚含量增量的相關(guān)性分析

經(jīng)測定，stage 1～stage 6竹根姜樣品中6-姜酚含量分別為182.37、498.47、528.56、486.70、478.14、489.34 μg/g。采用IBM SPSS Statistics18.0統(tǒng)計軟件對ZoWRKY1基因的表達量與6-姜酚含量增量進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ZoWRKY1基因的表達與6-姜酚含量相關(guān)系數(shù)為0.831 （P=0.040<0.05）。由此推測，竹根姜ZoWRKY1基因的表達水平與6-姜酚含量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4 ZoWRKY1及6-姜酚合成途徑酶基因在NaCl脅迫下的表達

以不同濃度NaCl處理的竹根姜根莖cDNA為模板進行ZoWRKY1基因以及6-姜酚合成途徑酶基因ZoPAL、ZoC4H和Zo4CL的qRT-PCR分析，結(jié)果如圖3所示，以0 g/L NaCl脅迫處理為對照組，當(dāng)NaCl脅迫濃度為25、50 g/L時，ZoWRKY1基因表達量迅速增加，分別上調(diào)了2.73、1.58倍;但隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加，ZoWRKY1基因的表達量又回落至對照組水平。而6-姜酚合成途徑相關(guān)酶基因ZoPAL、ZoC4H和Zo4CL 的表達量均在低鹽濃度（25 g/L）脅迫下高度表達，且與對照組差異極顯著。

進一步采用IBM SPSS Statistics18.0統(tǒng)計軟件對6-姜酚生物合成途徑相關(guān)酶基因與ZoWRKY1的表達量進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ZoC4H與Zo4CL基因的表達與ZoWRKY1相關(guān)系數(shù)分別為0.842（P=0.036<0.05）和0.965（P=0.002<0.01），均表現(xiàn)出顯著相關(guān)性;而ZoPAL基因的表達與ZoWRKY1的相關(guān)系數(shù)為0.794（P=0.059>0.05），并未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。由此推測生姜ZoWRKY基因與ZoC4H與Zo4CL的表達存在正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄因子基因工程技術(shù)是開展植物次生代謝遺傳改良的有效途徑，相比于合成酶基因，轉(zhuǎn)錄因子對次生代謝的調(diào)控能力更全面、更顯著，也更具改良前景。近年來相繼發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控，WRKY轉(zhuǎn)錄因子是其中的研究熱點之一。

該研究克隆到一個可能與生姜6-姜酚合成存在重要調(diào)控關(guān)系的WRKY轉(zhuǎn)錄因子ZoWRKY1。qRT-PCR及相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ZoWRKY1的表達水平在竹根姜發(fā)育的第二階段，即播種后一個月左右高度上調(diào)（圖2），且與6-姜酚含量增量存在顯著的相關(guān)性。由此推測6-姜酚的合成存在階段特異性，即播種一個月左右大量合成，在后期發(fā)育階段少量合成并逐漸積累。理論上講“姜是老的辣”，如果姜辣素是生姜主要的辣味物質(zhì)，那么隨著生姜的生長發(fā)育其姜辣素含量應(yīng)逐漸增加;在生長發(fā)育早期，根莖辣味不濃，即姜辣素含量應(yīng)該不高。然而該研究發(fā)現(xiàn)，6-姜酚在竹根姜發(fā)育早期大量合成，說明6-姜酚雖然是竹根姜藥用核心成分，但可能并非決定其辛辣程度的唯一指標(biāo)，推測竹根姜辛辣物質(zhì)為其他姜辣素成分。

鹽脅迫是影響作物最常見的非生物脅迫之一。在25 g/L NaCl脅迫下，ZoWRKY1在根莖中高表達，說明ZoWRKY1參與生姜的耐低鹽逆境應(yīng)答，這與前人研究報道的WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗逆反應(yīng)相一致[26-27]。結(jié)合ZoWRKY1的表達與6-姜酚含量增量存在顯著的相關(guān)性結(jié)果，推測在低濃度鹽脅迫下ZoWRKY1的表達增加與6-姜酚的生物合成有關(guān)，而采用25或50 g/L NaCl脅迫處理可誘導(dǎo)6-姜酚合成酶基因ZoPAL、ZoC4H和Zo4CL高度上調(diào)表達（圖3）則進一步驗證了這個猜想。6-姜酚生物合成途徑相關(guān)酶基因與ZoWRKY1的表達量相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ZoWRKY1與ZoC4H和Zo4CL的表達存在顯著相關(guān)性，推測ZoWRKY1與ZoC4H及Zo4CL基因存在調(diào)控關(guān)系并進一步影響6-姜酚的生物合成，但還需試驗進一步證實。

綜上所述，該研究克隆到竹根姜WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因ZoWRKY1，并發(fā)現(xiàn)該基因受低鹽逆境脅迫誘導(dǎo)高度上調(diào)表達;ZoWRKY1與6-姜酚生物合成酶基因ZoC4H和Zo4CL的表達存在顯著相關(guān)性，推測ZoWRKY1可能與6-姜酚生物合成存在重要調(diào)控關(guān)系。

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（責(zé)任編輯：成 平）