摘 要：為了建立準(zhǔn)確、簡便、靈敏、重現(xiàn)性好的莓茶代用茶中總黃酮（以二氫楊梅素計，下同）的檢測方法，特對檢測試劑、檢測波長、顯色反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：用70%乙醇50℃超聲提取4次（提取率達(dá)99.814%），以三氯化鋁和醋酸鉀進(jìn)行顯色反應(yīng)，在294 nm波長處檢測吸光度值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Abs =0.043 74 C×0.012 36，相關(guān)系數(shù)為0.999 94，線性范圍2.48～19.84 μg/mL。經(jīng)驗(yàn)證，該檢測方法重現(xiàn)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.980 7%;精密度良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.092 9%～0.415 5%;顯色反應(yīng)1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，吸光度值及檢測濃度值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.565%～1.178%。該方法最低檢測濃度為0.35 μg/mL。

關(guān)鍵詞：莓茶代用茶;總黃酮;二氫楊梅素;檢測方法;優(yōu)化

中圖分類號：S567; O652 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2020）10-0098-05

Abstract： To develop an accurate， simple， sensitive and repeatable method for the detection of total flavones （calculated in dihydromyricetin） in Ampelopsis grossedentata tea-like drink （one of tea substitutes）， the optimization for test reagents， detection wavelength selection and color reaction was made. Ultrasonic extraction was conducted with 70% ethanol at 50 °C for 4 times （the extraction rate was 99.814%）， color reaction was performed with aluminum trichloride and potassium acetate， the absorbance value was measured at 294 nm， then a standard curve equation Abs =0.043 74×C-0.012 36 was constructed where the correlation coefficient was 0.999 94， and the linear range was 2.48～19.84 μg/mL. The results have proved that the method is of a good repeatability with the relative standard deviation RSD （n=5） of 0.980 7% ， and high accuracy with the RSD （n=5） of 0.092 9%～0.415 5%. The color reaction is stable within 1h， and the RSD （n=5） is 0.565%～1.178% for the absorbance value and the detected concentration value. The minimum detection concentration of this method is 0.35 μg/mL.

Key words： Ampelopsis grossedentata tea-like drink; total flavones; dihydromyricetin; detection method; condition optimization

葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossed-entata），俗名莓茶，又稱為藤茶、茅巖莓等。莓茶是一種野生藤本植物，廣泛分布于我國湖南、湖北、貴州、江西等省份，其鮮葉可加工成莓茶代用茶，故被廣泛人工種植。湖南省湘西州種植莓茶歷史悠久，有“溪洲莓茶”、“永順莓茶”（國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記，己通過評審）等標(biāo)志或品牌[1]。2013年12月24日原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，將莓茶葉納入可用于食品生產(chǎn)加工的新食品原料管理[2]，從此，莓茶代用茶納入我國食品生產(chǎn)許可發(fā)證范圍。2019年國家衛(wèi)健委將莓茶葉列入最新版食藥同源目錄[3]，由此開啟莓茶葉食藥兩用新用途的廣闊發(fā)展空間。近年來莓茶代用茶產(chǎn)業(yè)己成為湘西自治州永順縣和鳳凰縣脫貧攻堅及鄉(xiāng)村振興的政府扶持項(xiàng)目。同時莓茶食用藥用價值研究成為廣大科研工作者的研究方向，張紅忠等[4]綜述了藤茶的植物學(xué)研究與加工、化學(xué)成分和藥理作用;劉慧穎等[5]總結(jié)了莓茶的化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展;馮涵林等[6]對藤茶中黃酮類成分的功效進(jìn)行了綜述。

食品中總黃酮的測定方法主要有直接測定法、薄層色譜法、分光光度計比色法等，食品中黃酮單體成分測定方法主要是高效液相色譜法。比色法具有快速、簡單、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，測定食品中總黃酮時常用比色法有直接比色法（如保健食品中總黃酮的測定[7]）、顯色劑比色法（如三氯化鋁416 nm比色法[8]、三氯化鋁-醋酸鉀415 nm比色法[9]、硝酸鋁-醋酸鉀415 nm比色法[10]、亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉510 nm比色法[11]）等，通常，會根據(jù)產(chǎn)品的特性選擇不同的檢驗(yàn)方法。經(jīng)查文獻(xiàn)資料，莓茶或藤茶中總黃酮檢測研究有秦亞茹等[12]藤茶總黃酮檢測方法的對比研究，李宇等[13]利川市藤茶黃酮成分研究，其中藤茶中總黃酮的代表成分主要為二氫楊梅素和楊梅素等。

為了建立一套準(zhǔn)確、簡便、靈敏、重現(xiàn)性好的莓茶代用茶中總黃酮（以二氫楊梅素計，下同）的檢測方法，為莓茶代用茶及其總黃酮的開發(fā)應(yīng)用提供檢測方法、應(yīng)用基礎(chǔ)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，筆者擬用三氯化鋁醋酸鉀為顯色劑，對檢測試劑、檢測波長及顯色反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀 器 UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津）、BSA-224S分析天平（賽多利斯）、JY502天平（上海浦春計量）、KQ5200V型超聲波清洗器、DZKW電熱恒溫水浴鍋、ZWT-H1-20超純水機(jī)（中沃水務(wù)）、常用玻璃器皿等。

1.1.2 試 劑 無水乙醇（UV-HPLC，含量≥99.9%;AR，含量≥99.7%）;95%乙醇（AR）;90%、70%、30%乙醇水溶液（自配）;三氯化鋁（AR，含量≥99.0%）;25 g/L三氯化鋁;醋酸鉀（AR，含量≥92.0%）;冰醋酸（AR，含量≥99.5%）;98.2 g/L醋酸鉀（100 mL中含4 mL冰醋酸）。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 以中藥對照品二氫楊梅素（A0049 20 mg，含量99.57%）為試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品;稱取0.012 4 g二氫楊梅素用95%乙醇溶解定溶至25 mL容量瓶中，配成496 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ;標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ用95%乙醇稀釋10倍，配成49.6 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅱ;標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅱ用95%乙醇稀釋10倍，配成4.96 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅲ。

1.1.4 試驗(yàn)樣品 檢測樣品為湖南省永順縣毛壩鄉(xiāng)、砂壩鄉(xiāng)、潤雅鄉(xiāng)、石堤鎮(zhèn)、萬民鄉(xiāng)及萬坪鎮(zhèn)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)莓茶生產(chǎn)企業(yè)的成品，試驗(yàn)樣品為湖南省市場監(jiān)督管理局科技項(xiàng)目（2020KJJH72）的研究樣品。樣品在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行簡單復(fù)干（70℃恒溫復(fù)干0.5 h）→粉碎→備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 精確稱取約0.5 g干燥的莓茶粉末置于100 mL比色管中，加入70%乙醇溶液25 mL浸潤混勻，在50℃水浴超聲提取0.5 h，趁熱過濾至100 mL容量瓶中，如此重復(fù)提取4次，合并提取液并用70%乙醇清洗殘渣和濾紙，用70%乙醇定容至100 mL，搖勻靜置（必要時進(jìn)行4 000 r/min離心8 min處理），此提取液必要時可用70%乙醇進(jìn)行稀釋，備用或4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制及樣品檢測 精確吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅱ（49.6 μg/mL二氫楊梅素標(biāo)液）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 于 10 mL 比色管中，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0、2.48、4.96、9.92、14.88、19.84 μg/mL;精確吸取樣品處理液1.5～2.0 mL于10 mL 比色管中;在標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品比色管中先加入一定量70%乙醇液，再加入25 g/L三氯化鋁2 mL搖勻放置5 min后，再加入98.2 g/L醋酸鉀2 mL，用70%乙醇定容搖勻，顯色反應(yīng)15 min后于294 nm波長處測定吸光度值。

1.2.3 結(jié)果計算 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，按下列公式計算出所測樣品中總黃酮含量。

式中C為總黃酮含量（g/kg），ρ為樣品處理液檢測濃度（μg/mL），由樣品吸光度值代入線性方程而得出，10為比色管定容體積（mL），m為莓茶的質(zhì)量數(shù)（g），V1為比色用處理液體積（mL），V2：處理液定容體積（mL），F(xiàn)為處理液稀釋倍數(shù)，1 000為單位換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件驗(yàn)證

2.1.1 試驗(yàn)用水驗(yàn)證 用UV-2550儀對試驗(yàn)用純凈水和超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）在200～900 nm波長進(jìn)行光譜掃描，掃描結(jié)果顯示，2種試驗(yàn)用水在200～900 nm波長范圍內(nèi)均無吸收峰，且2種試驗(yàn)用水在250～900 nm光譜圖平直一致，說明2種試驗(yàn)用水無吸收峰均不影響試驗(yàn)結(jié)果，故該試驗(yàn)用純凈水即可。

2.1.2 試驗(yàn)用有機(jī)溶劑驗(yàn)證 試驗(yàn)各種乙醇溶液（液相色譜純無水乙醇、AR市售無水乙醇、95%市售乙醇、90%自配乙醇液、70%自配乙醇液、30%自配乙醇液）在200～700 nm波長范圍進(jìn)行光譜掃描，掃描結(jié)果顯示，6種乙醇溶液在200～700 nm波長范圍內(nèi)均無吸收峰，且在250～700 nm光譜圖平直一致，說明6種乙醇溶液均能滿足試驗(yàn)要求。綜合考慮，試驗(yàn)用有機(jī)溶劑選擇AR無水乙醇、95%AR乙醇及70%乙醇即可。

2.1.3 單一顯色試劑驗(yàn)證 分別吸取25 g/L三氯化鋁和98.2 g/L醋酸鉀各2 mL到2支10 mL比色管中，并用70%乙醇定容混勻，在200～900 nm波長范圍進(jìn)行光譜掃描，掃描結(jié)果顯示，2種單一顯色反應(yīng)試劑在200～900 nm波長范圍內(nèi)均無吸收峰，且在約250～900 nm光譜圖平直一致，表明2種單一顯色劑能滿足試驗(yàn)要求。

2.1.4 混合顯色試劑驗(yàn)證 取少量70%乙醇于10 mL比色管中，加入25 g/L三氯化鋁2 mL搖勻，放置5 min后加入98.2 g/L醋酸鉀2 mL，用70%乙醇定容搖勻，放置15 min后在200～900 nm波長范圍進(jìn)行光譜掃描，掃描結(jié)果顯示，2種顯色反應(yīng)試劑混合后在200～900 nm波長范圍內(nèi)均無吸收峰，且在約250～900 nm光譜圖平直，表明2種顯色試劑混合后能滿足試驗(yàn)要求。

2.1.5 同濃度二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液加與不加顯色劑光譜掃描（即檢測波長選擇） 配制二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液430 μg/mL（稱取二氫楊梅素0.004 3 g，用95%乙醇溶解定容于10 mL容量瓶中），準(zhǔn)確吸取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL分別置于2支10 mL比色管中（即濃度為8.6 μg/mL），其中1支比色管按1.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列顯色方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，放置15 min后進(jìn)行光譜掃描;另1支比色管用70%乙醇定容搖勻，放置15 min后掃描，掃描結(jié)果顯示，未加顯色劑的二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液其在294.5 nm和328.5 nm波長處有不明顯吸收峰，且兩峰間峰形相連，此光譜圖與二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液液相光譜圖（290 nm有吸收峰，約330 nm吸收峰不明顯）相似;加入顯色劑的二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液在294 nm波長有唯一明顯最大吸收峰，Abs值為0.536。由此即驗(yàn)證二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液與顯色劑反應(yīng)后在294 nm波長處有唯一明顯最大吸收峰。

2.1.6 不同濃度二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液加顯色劑光譜掃描（即檢測波長選擇） 配制不同濃度二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)系列（濃度為2.397 5、4.795、9.590、14.385、19.180、23.975 μg/mL），按1.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列顯色方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，放置15 min后掃描，掃描結(jié)果顯示，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與其吸收峰Abs值大小成一定正比例關(guān)系。綜合分析1.3.5和1.3.6，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入顯色劑掃描，在294 nm波長處有唯一明顯最大吸收峰，且濃度與吸光度值成正比例關(guān)系。故此法選擇檢測波長為294 nm。

2.1.7 樣品溶液及二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液加與不加顯色劑光譜掃描（即檢測波長選擇及總黃酮以二氫楊梅素計的驗(yàn)證） 稱取樣品0.515 7 g按1.2.1方法進(jìn)行提取，提取液再按1∶25進(jìn)行稀釋，吸取稀釋液1.5 mL分別置于2支10 mL比色管中，其中1支比色管按1.2.2樣品顯色方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，放置15 min后掃描;另1支比色管用70%乙醇定容搖勻，放置15 min后掃描，掃描結(jié)果顯示，未加顯色劑的樣品溶液其在294 nm波長處有不明顯吸收峰，在約330 nm波長處有不明顯吸收峰，且2個不明顯吸收峰之間峰形相連，此峰形與二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液未加顯色劑光譜掃描圖一致;加入顯色劑的樣品溶液在294 nm波長有唯一明顯最大吸收峰，Abs值為0.681。

再比較二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加入顯色劑光譜掃描結(jié)果顯示，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加顯色劑光譜掃描圖一致，在294 nm波長有唯一明顯最大吸收峰，且標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值成正比例關(guān)系。

綜合分析1.3.5～1.3.7，科學(xué)驗(yàn)證莓茶中總黃酮檢測，用三氯化鋁醋酸鉀為顯色試劑，在294 nm波長處測其吸光度值。

2.1.8 同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加與不加顯色劑光譜掃描（即驗(yàn)證莓茶總黃酮不以蘆丁計） 以中藥對照品蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號153-18-4，含量98.41%），配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液128 μg/mL（稱取蘆丁0.012 8 g，用95%乙醇溶解定容100 mL容量瓶），準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL分別置于2支10 mL比色管中（即濃度為19.2 μg/mL），其中1支比色管按1.2.2顯色方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，放置15 min后光譜掃描;另1支比色管用70%乙醇定容搖勻，放置15 min后光譜掃描，掃描結(jié)果顯示，未加顯色劑的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液其在258 nm和363.5 nm波長處有吸收峰，此光譜圖與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液相光譜圖一致（在256 nm和354 nm波長處有吸收峰），且兩峰間峰形相連;加入顯色劑的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在269.5 nm和409.5 nm有吸收峰，且兩峰間峰形相連。同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加與不加顯色劑光譜圖峰形一致，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加入顯色劑后吸收峰延后。

再比較分析二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液（8.6 μg/mL）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（19.2 μg/mL）和樣品加入顯色劑光譜掃描結(jié)果顯示，莓茶總黃酮檢測以二氫楊梅素計而不宜以蘆丁計，檢測波長為294 nm。

通過以上試驗(yàn)及綜合分析1.3.1～1.3.8，充分驗(yàn)證莓茶總黃酮的檢測，采用三氯化鋁醋酸鉀顯色反應(yīng)，在294 nm波長處有唯一明顯最大吸收峰，且標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值與其吸光度值成正比例關(guān)系。

2.2 標(biāo)曲線性繪制

根據(jù)不同濃度范圍的二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線①、②、③、④，其線性方程分別為Abs1=0.043 74×C1-0.012 36、Abs2=0.044 04×C2-0.062 01、Abs3=0.043 73×C3+0.033 07、Abs4=0.042 02×C4 +0.001 50，如表1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線①二氫楊梅素濃度范圍為0～19.84 μg/mL，吸光度值0～0.869，經(jīng)分析，其估計的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.067 74 μg/mL，殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.060 59?μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.999 94;標(biāo)準(zhǔn)曲線②二氫楊梅素濃度范圍為0～29.76 μg/mL，吸光度值0～1.317，其估計的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.123 91 μg/mL，殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.114 72 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.999 89;標(biāo)準(zhǔn)曲線③二氫楊梅素濃度范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線①相同，吸光度值為0～0.870，其估計的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.045 02 μg/mL，殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.040 26 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.999 97;標(biāo)準(zhǔn)曲線④二氫楊梅素濃度范圍為0～4.96 μg/mL，其吸光值0～0.208，估計的標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.002 23 μg/mL，殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.002 00 μg/mL，關(guān)系數(shù)為0.999 38。分析顯示，4個系列標(biāo)準(zhǔn)曲線均在預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差線和95%置信水平線線內(nèi)（電腦系統(tǒng)查得），相關(guān)系數(shù)均≥0.999 38，遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)要求（0.99）[14]，表明這些標(biāo)準(zhǔn)曲線符合朗伯比耳定律，偏離度較小或影響較小，穩(wěn)定性良好，同時考慮吸光度值（Abs值）不宜過大，試驗(yàn)以2.48～19.84 μg/mL范圍作為檢測分析依據(jù)。

2.3 最佳提取次數(shù)

稱取莓茶樣品0.554 2 g按1.2.1進(jìn)行分次提取試驗(yàn)，第一次提取液用70%乙醇定容至50 mL，再以體積比1∶50稀釋;第二次提取液用70%乙醇定容至50 mL，再以體積比1∶10稀釋;第三、四次提取液用70%乙醇定容至50 mL;第五、六次提取液用70%乙醇定容至25 mL;檢測每次提取液樣品濃度，提取次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表2。由表2分析可見，總黃酮第一次提取率93.464%，前兩次提取率達(dá)99.160%，前三次提取率達(dá)99.673%，前四次提取率達(dá)99.814%。綜合分析得出莓茶總黃酮檢測70%乙醇提取四次合并定容為佳，提取率達(dá)99.814%。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取5份樣品各約0.5 g按1.2進(jìn)行檢測。重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表3。由表3分析可見，標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.404 8，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.980 7%，RSD值遠(yuǎn)小于 5.0 %;同時再分析比較標(biāo)曲①和標(biāo)曲③檢測數(shù)據(jù)，可見5個同濃度標(biāo)曲點(diǎn)對應(yīng)的Abs值也非常接近，說明該試驗(yàn)方法平行樣檢測及標(biāo)曲系列測定重現(xiàn)性較好。

2.5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

配制二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)4.960、9.920和14.880?μg/mL，精確吸取樣品1稀釋液1.0、1.5 mL，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和樣品按1.2.2進(jìn)行顯色反應(yīng)，在294 nm波長處連續(xù)測定檢測濃度值5次，精密度試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表4。由表4分析可見，5組精密度試驗(yàn)其檢測濃度RSD（n=5）值0.092 9%～0.415 5%，均遠(yuǎn)小于5%，其中3組標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)其標(biāo)準(zhǔn)值與檢測平均值比值在95.320 5%～99.542 4%，均大于95%，表明顯色反應(yīng)吸光度值穩(wěn)定、儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

分別吸取二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)使用液Ⅱ2 mL和5 mL到2支25 mL比色管中，配制成二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3.968和9.92 μg/mL;精確吸取樣品1稀釋液3.75 mL到2支25 mL比色管中，配制成同濃度的樣品檢測液1-1和1-2。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和樣品按1.2.2加入顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL，測定標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和樣品不同顯色反應(yīng)時間吸光度值及檢測濃度值，試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表5。從表5分析可見，吸光度值及檢測濃度值在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）在0.565%～1.178%，均小于5%;且2組標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)值與檢測平均值比值為96.993%和99.729 %。證明該方法顯色反應(yīng)2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，綜合分析此顯色反應(yīng)在1 h內(nèi)完成比色工作最佳。

2.7 最低檢測濃度

將低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)曲④）進(jìn)行再稀釋檢測其濃度，以了解此法對標(biāo)準(zhǔn)溶液低濃度的檢出情況。通過多次試驗(yàn)，得知該方法最低檢測濃度為0.35 μg/mL，吸光度值0.015，如濃度更低則其吸光度值將不穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)通過光譜掃描驗(yàn)證試驗(yàn)用水、試驗(yàn)用有機(jī)溶劑、單一顯色試劑和混合顯色試劑，證明試驗(yàn)用材料對該試驗(yàn)無影響;通過比較分析二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液加與不加顯色劑光譜掃描、不同濃度二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液加顯色劑光譜掃描、樣品溶液加與不加顯色劑光譜掃描以及二氫楊梅素液相色譜光譜比較，確定檢測波長為294 nm;通過比較分析蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加與不加顯色劑光譜掃描、樣品、二氫楊梅素及蘆丁加與不加顯色劑光譜掃描，得出莓茶中總黃酮檢測以二氫楊梅素計較適宜。

莓茶中總黃酮（以二氫楊梅素計），用70%乙醇50℃超聲提取4次（提取率達(dá)99.814%），用三氯化鋁和醋酸鉀顯色反應(yīng)，在294 nm波長處檢測吸光度值，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍2.48～19.84 μg/mL，吸光度值0.112～0.869，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Abs =0.043 74×C-0.012 36，相關(guān)系數(shù)0.999 94。該方法重現(xiàn)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.980 7%;該方法及儀器精密度良好穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.092 9%～0.415 5%，標(biāo)準(zhǔn)濃度值與檢測平均值比值95.320 5%～99.542 4%;該方法顯色反應(yīng)1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，吸光度值及檢測濃度值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為0.565%～1.178%，標(biāo)準(zhǔn)濃度值與檢測平均值比值96.993%～99.729%;該方法最低檢測濃度0.35 μg/mL，吸光度值0.015。通過檢測試劑驗(yàn)證、檢測波長選擇、顯色反應(yīng)驗(yàn)證和方法驗(yàn)證對該方法進(jìn)行全面試驗(yàn)和驗(yàn)證，形成完整全面科學(xué)的莓茶總黃酮（以二氫楊梅素計）的檢測方法，此檢測方法具有準(zhǔn)確、簡便、靈敏、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可為莓茶代用茶及其總黃酮的開發(fā)應(yīng)用提供檢測方法、應(yīng)用基礎(chǔ)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）