張曉佳 盧亞軍 張文晉，3 張瑜 崔高暢 郎多勇 張新慧，3

（1. 寧夏醫(yī)科大學藥學院，銀川 750004；2. 天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津 300122；3. 寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，銀川 750004）

逆境脅迫是對植物生長發(fā)育和生存不利的各種環(huán)境因素的總和，主要分為生物脅迫和非生物脅迫。逆境在植物自然生長過程中時常會對其造成損傷，嚴重時甚至會導致植物死亡［1］。目前化學農(nóng)藥、化肥雖然可以暫時緩解某些逆境脅迫，但長期使用不僅誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且易傷害非靶標生物，污染環(huán)境，嚴重破壞生態(tài)平衡［2］。因此，積極開發(fā)微生物菌劑具有重要的理論和實際價值。

微生物菌劑（Microbial agents），通稱為生物肥料、菌肥、接種劑，是一類以微生物生命活動及其產(chǎn)物使農(nóng)作物得到特定肥料效應的微生物活體制品。微生物是土壤最活躍的組成，土壤微生物被稱為土壤C、N、S和P等養(yǎng)分元素的“轉(zhuǎn)化器”，環(huán)境污染的“凈化器”［3］。劉洪光［4］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫條件下接種AM真菌作為生物肥料，具有提高枸杞生長，以及改善枸杞產(chǎn)品品質(zhì)的潛力。何艷慧［5］研發(fā)了一款微膠囊菌劑并發(fā)現(xiàn)其對棉花具有解鹽、促生效果。武海濤［6］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌液可以有效減緩鉛對植物的傷害，從而增強小麥對鉛脅迫的適應性。只要條件適合，肥料中的微生物就能夠保持其自身旺盛的繁殖力和進行新陳代謝等生命活動，進而進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生有益的代謝物，增加植物養(yǎng)分的供應，促進植物生長，增強植物抗逆性，改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境及提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)［7］。

由于短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）能產(chǎn)生熱穩(wěn)定的內(nèi)生芽孢，且耐高溫、耐酸堿及耐擠壓等抗逆能力強，并對多種病原真菌、細菌均有較強的抑制作用，抗菌譜廣泛，成為越來越受矚目的生防研究材料之一［8］。實驗室前期從甘草根中分離純化獲得一株優(yōu)良菌株，經(jīng)生測實驗具有耐鹽、酸堿性，對多種病原菌具有拮抗活性［9］，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌。且經(jīng)盆栽實驗表明該菌可定植于甘草內(nèi)部，從而緩解干旱脅迫，促進生長［10］。本研究對短小芽孢桿菌進行發(fā)酵條件優(yōu)化實驗，獲得制備高產(chǎn)新型微生物菌劑的制備工藝，并研究該菌劑對旱鹽逆境脅迫下甘草幼苗的發(fā)芽、生長情況，考察其對甘草抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)、碳氮代謝過程的影響，旨為以后植物抵抗逆境脅迫開辟新的途徑［11］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 短小芽孢桿菌保藏號為CGMCC No.16879：課題組前期從甘草根中分離、純化、鑒定所得。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基） 葡萄糖1.5%；牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%；無機鹽NaCl 0.5%；水96%，用NaOH或HCl調(diào)pH 至7-8，121℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基向其中加1.6%的瓊脂。

1.1.3 種子培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基） 牛肉膏0.3%；蛋白胨1.0%；NaCl 0.5%；其余為水。調(diào) pH至7-8，121℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基向其中加1.6%的瓊脂。

1.1.4 主要試劑 葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、D-聚糖、D-木糖、可溶性蛋白、酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、Na2HPO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H20和KH2PO4等。

1.1.5 儀器設備 紫外分光光度計、高溫滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平；培養(yǎng)皿、玻璃棒、試管及試管架、燒杯和錐形瓶等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將分離得到的短小芽孢桿菌菌株轉(zhuǎn)接到NA固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.2 種子液的制備 挑取單菌落，接入NA培養(yǎng)基中，置于控溫搖床，30℃，170 r/min培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.3 菌體生物量測定方法 采用比濁法［12］檢測菌體量：將發(fā)酵液稀釋100倍，以未接種培養(yǎng)基作對照稀釋100倍后分光光度計275 nm處檢測吸光度。

1.2.4 短小芽孢桿菌培養(yǎng)基篩選優(yōu)化 單因素篩選發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽的種類和濃度，碳源種類設為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、D-聚糖、D-木糖和可溶性蛋白，濃度為0.5%-5.0%。氮源設為酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨及牛肉膏，濃度為0.5%-5.0%。無機鹽為Na2HPO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H20、KH2PO4、NaCl和NaOH，濃度為0.01%-0.08%。在單因素試驗的基礎(chǔ)上選用3因素3水平L9（33）正交表（表1）進行實驗，以尋求培養(yǎng)基中各組分的最佳配比。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成因素和水平

1.2.5 短小芽孢桿菌發(fā)酵工藝的篩選優(yōu)化 以實驗室前期篩選優(yōu)化所得發(fā)酵配方進行接下來的發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗。探究發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量及裝液量單因素對短小芽孢桿菌生長的影響。以基礎(chǔ)發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，考察某因素時，固定其他因素。發(fā)酵時間從12 h開始考察，每隔6 h取樣測定OD275；發(fā)酵溫度設置為26-42℃；初始pH3-10；搖床轉(zhuǎn)速110 r/min-230 r/min；接種量0.5%-5.0%；裝液量50/250-230/250 mL。以單因素試驗結(jié)果作為中心點，發(fā)酵液OD275為響應值，進行RSM設計［13］。每個試驗重復3次，取其平均值，試驗因素水平及相應的編碼見表2。RSM方法采用“Design-Expert 8.0.6”esignBBD模型，得到6因素3水平共54組的試驗設計（表3）。將實驗后的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，并對回歸方程進行方差分析及擬合度檢驗，討論模型所在響應面特征，預測最大響應值并驗證模型。

表2 響應面分析因素與水平

1.2.6 短小芽孢桿菌菌劑制備 經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵工藝生產(chǎn)所得發(fā)酵液即為短小芽孢桿菌液體菌劑。液體菌劑呈深褐色，有效活菌數(shù)為425 CFU/mL，pH7-8，存放于4℃冰箱備用。施用方式為稀釋50倍，浸種。

1.2.7 甘草水培發(fā)芽試驗 甘草種子收獲于2019年，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學藥學院張新慧教授鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）種子。凈種后，將其裝入牛皮紙袋置于冰箱冷藏室貯藏。

1.2.7.1 種子預處理 本試驗精選籽粒飽滿、大小均一的甘草種子，先用85%濃H2SO4浸潤45 min，不定時攪拌，然后用蒸餾水沖洗3遍，再用0.1%的H2O2消毒10 min，最后用蒸餾水沖洗數(shù)次至無黏性，洗凈后置于燒杯中，用蒸餾水浸泡6-8 h使種子充分吸水，待用。

1.2.7.2 實驗設計 采用完全隨機設計，鹽基采用中性鹽NaCl，濃度為100 mmol/L；聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）6000模擬干旱脅迫，濃度為10%；處理分別為對照（CK）、鹽脅迫（S）、干旱脅迫（D）、對照加菌（CK+B）、鹽脅迫加菌（S+B）、干旱脅迫加菌（D+B）。選取充分吸水、飽滿均一的甘草種子，吸干表面水分，將其均勻擺放在墊有雙層無菌濾紙并加入5 mL不同濃度處理溶液的培養(yǎng)皿（9 cm × 9 cm × 3 cm）中進行萌發(fā)，每皿40粒。實驗條件為光照/黑暗（12 / 12 h，28 / 20℃）。每天用稱重法加蒸餾水至恒質(zhì)量以保持恒定的處理液濃度。實驗第2天測定發(fā)芽數(shù)，第6天基本發(fā)芽結(jié)束，第9天采樣，采樣過程中測定生長及生理生化指標。

1.2.7.3 生長及生理生化特性測定

（1）種子萌發(fā)指標測定

發(fā) 芽 率（%）=（發(fā) 芽 種 子 數(shù)/供 試 種 子數(shù)）×100%；

發(fā)芽勢（%）=（規(guī)定日期內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；

發(fā)芽指數(shù)=Σ第幾日的發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗第幾日）。

幼苗活力指數(shù)=幼苗生長量（長度或重量）×發(fā)芽指數(shù)。

（2）生長指標測定 用直尺測定甘草胚芽、胚根長度，游標卡尺測定胚芽、胚根的粗度等生長指標。

（3）抗逆生理生化指標測定 谷胱甘肽（Glutathione，r-glutamyl cysteingl +glycine，GSH）、抗環(huán)血酸AsA含量測定采取分光光度法［14］：可溶性蛋白測定采取考馬斯亮藍法，可溶性糖測定采取蒽酮比色法［15］；硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）、蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）測定采取比色法［16］。

表3 響應面設計

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗，多重比較用Duncan法（P＜ 0.05），Excel 2003作圖，圖中的數(shù)據(jù)均為3次重復的均值± 標準誤。響應面分析采用Design Expert 8.0.6 軟件。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，適合短小芽孢桿菌生長的最佳碳源是麥芽糖，最佳重量百分比為4.5%；適合短小芽孢桿菌生長的最佳氮源是大豆蛋白胨，最佳重量百分比為3.5%；適合短小芽孢桿菌生長的最佳無機鹽是KH2PO4，最佳重量百分比為0.02%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果

由表4可知，極差分析結(jié)果為：RC＞RA＞RB，各因素影響菌體生長程度從大到小為KH2PO4＞麥芽糖＞大豆蛋白胨。最佳組合為 A1B1C1，即麥芽4.0%，大豆蛋白胨3.0%，KH2PO40.01%。

由表5方差分析可得：麥芽糖、KH2PO4對OD275值均有顯著影響，而大豆蛋白胨沒有顯著影響。但其影響的程度有較大差異，這3個因素對菌體生物量OD275值作用的大小依次為：A＞C＞B，即各因素影響菌體生長程度從大到小為麥芽糖、KH2PO4、大豆蛋白胨。綜上可得：極差分析與方差分析結(jié)果均顯示最佳組合為 A1B1C1，即麥芽糖4.0%、大豆蛋白胨3.0%、KH2PO40.01%。

2.3 優(yōu)化后的最佳組合培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較

短小芽孢桿菌分別在優(yōu)化后的培養(yǎng)基與優(yōu)化前的培養(yǎng)基中，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用常規(guī)的發(fā)酵工藝在250 mL 的恒溫搖床中發(fā)酵，用紫外分光光度法測定OD275值；優(yōu)化后的培養(yǎng)基較優(yōu)化前OD275值顯著增159.4%

2.4 發(fā)酵工藝單因素試驗結(jié)果

由圖2可知，不同的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量對菌體的生物量有顯著影響（P＜0.05）。單因素試驗可得：發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量2.0%，裝液量為110 mL/250 mL，并選擇其作為下一步響應面試驗的中心試驗點。

2.5 發(fā)酵工藝響應面優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 響應面模型的建立 響應面試驗設計及結(jié)果見表3。利用Design Expert 8.0軟件對表5數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得的響應值菌體生物量（Y）對 編 碼 自 變 量 X1、X2、X3、X4、X5和X6的 二 次多項式回歸模型方程為Y=24.81-0.03X1-0.39X2-3.05X3-0.08X4+0.49X5+0.02X6+5.97X1X2+4.96X1X3+7.65X1X4+8.79X1X5-2.24X1X6+0.03X2X3+1.35X2X4-2.28X2X5-2.94X2X6-1.52X3X4-0.03X3X5+2.64X3X6-2.7 6 X4X5+2.4 6 X4X6+1.4 8 X5X6-4.1 2 X12-1.24X22+0.12X32+1.33X42-0.02X52-1.48X62。

2.5.2 回歸模型方差分析 對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表6?？梢钥闯觯貧w模型的P=0.000 2，失擬項的P= 0.233 2，模型回歸極顯著，失擬檢驗不顯著，說明未知因素對實驗結(jié)果干擾很小，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當。

2.5.3 響應面圖及其等高線 由回歸方程所作的響應面立體分析圖及其等高線如圖3-4所示，其中X1X2、X1X3、X1X4、X1X5、X2X5、X2X6及X5X6這7組響應面均為開口向下的凸形曲面，且通過方程可知，X1、X2、X3及X4二次項的系數(shù)均為負值，其所表征的拋物面開口向下，說明響應值存在極高值。軟件所得數(shù)據(jù)結(jié)合實際確定最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)酵時間為42 h、發(fā)酵溫度為34℃初始pH為7.00、搖床轉(zhuǎn)速為230 r/min、接種量為2.0%、裝液量為

100 mL/250 mL。

2.6 回歸模型的驗證

實際值與預測值擬合率達82%，有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。同時，優(yōu)化后的菌體生物量比優(yōu)化前提高了4.3倍，明顯提高了短小芽孢桿菌的生物量。

2.7 短小芽孢桿菌菌劑對旱鹽脅迫下甘草發(fā)芽及生長情況的影響

圖1 碳源、氮源、無機鹽的種類及重量百分比對菌體生物量的影響

由圖5-6可知，接種微生物菌劑后，甘草幼苗發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)均有不同程度增長。發(fā)芽勢最高，在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑甘草的發(fā)芽勢顯著增長14%；發(fā)芽指數(shù)最高，在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑甘草的發(fā)芽指數(shù)顯著增長15%；幼苗活力指數(shù)最高在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑顯著可增長18%。接種微生物菌劑后，甘草胚根長度、胚根粗度、胚芽長度、胚芽粗度均有不同程度的增長，最高在干旱脅迫下接種菌劑較干旱脅迫下未接種菌劑甘草胚芽長度增長33%。

表4 正交試驗設計和結(jié)果

表5 方差分析

2.8 短小芽孢桿菌菌劑對旱鹽脅迫下甘草抗氧化指標的影響

由圖7可知，甘草抗氧化系統(tǒng)指標中GSH、AsA接種微生物菌劑后，對鹽脅迫下的甘草幼苗的影響尤為顯著。鹽脅迫下接種菌劑甘草幼苗中GSH含量較未接種菌劑顯著提高44%，AsA含量較未接種菌劑顯著提高64%。

2.9 短小芽孢桿菌菌劑對甘草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖8所示，在接種微生物菌劑后，對甘草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白具有顯著影響，對鹽脅迫下的甘草幼苗的影響尤為顯著。鹽脅迫下接種菌劑甘草幼苗中可溶性糖含量較未接種菌劑顯著提高140%，可溶性蛋白含量較未接種菌劑顯著提高45%。

2.10 短小芽孢桿菌菌劑對甘草碳氮代謝酶活性的影響

如圖9所示，在接種微生物菌劑后，甘草幼苗碳氮代謝酶NR、INV活性增加，對鹽脅迫、干旱脅迫下的甘草幼苗均有顯著影響，干旱脅迫下接種菌劑甘草幼苗中NR酶活性較干旱脅迫下不接種菌劑顯著增加77%，鹽脅迫下接種菌劑INV酶活性較鹽脅迫下未接種菌劑顯著增加445.5%。

3 討論

3.1 菌劑制備過程中的的影響因素

微生物菌劑的研究開發(fā)應用受到生物肥料及農(nóng)藥等研究開發(fā)者的普遍重視，產(chǎn)品種類繁多。液體菌劑由于生產(chǎn)周期短、水溶性好、施肥方式簡便而廣受歡迎，但在研究、生產(chǎn)和應用中也存在不少的問題，其中之一就是發(fā)酵液的活菌數(shù)量不高，限制了產(chǎn)品的推廣使用。本研究將菌劑制備過程中的影響因素主要分為發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝兩大模塊進行探討。王美英等［17］研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌對麥芽浸粉的利用率最高，可以作為生產(chǎn)芽孢的有效碳源。林戎斌等［18］以細胞生物量為指標篩選優(yōu)化地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基時發(fā)現(xiàn)大豆蛋白胨為其最適氮源。有研究表明，鉀離子可提高細菌發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量，提高其催化及代謝功能，增強抑菌活性［19-20］。吳婷婷［8］以芽孢數(shù)量篩選優(yōu)化短小芽孢桿菌Y11的培養(yǎng)基時發(fā)現(xiàn)KH2PO4對其具有顯著影響。以上研究與本研究結(jié)果一致，采用優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基菌體生物量提高了將1.59倍。本研究發(fā)現(xiàn)，短小芽孢桿菌在12 h-18 h快速生長，36 h時短小芽孢桿菌的生物量達到最大值。當菌體的發(fā)酵溫度升高達到30℃時，菌體生物量達到峰值。這與尹萌萌等［21］研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶、菌體生長的最適培養(yǎng)溫度為28℃基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)當發(fā)酵pH6.0菌體生物量達到第一個峰值，當發(fā)酵pH值為8.0時達到第二個峰值，此時為菌體生物量的最大值，這可能與菌體自身的某些生物學特性有關(guān)，呈現(xiàn)明顯的嗜弱酸、弱堿性［22］。在本研究中，短小芽孢桿菌在其他水平接種量時菌體生物量并無明顯升高及降低，但在接種量為2.0%時菌體的生物量明顯升高，有大量研究發(fā)現(xiàn)，接種量2.0%時菌體生長最好，與本研究結(jié)果一致［23］。液體發(fā)酵過程中氧濃度對菌體生長影響顯著，最直接的體現(xiàn)在搖瓶的裝液量，本研究發(fā)現(xiàn)，裝液量在110 mL/250 mL-140 mL/250 mL時，短小芽孢桿菌生物量較高，這可能與芽孢桿菌為嚴格需氧與兼性厭氧菌種的生物特性有關(guān)［24］。

圖2 發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH等6個單因素對菌體生物量的影響

表6 回歸模型方差分析

圖3 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、初始pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速的交互作用所得3D響應面

3.2 菌劑對旱鹽脅迫下甘草生長及發(fā)芽情況的影響

圖4 發(fā)酵溫度與接種量、裝液量的交互作用及接種量與裝液量的交互作用所得3D響應面

圖5 不同處理甘草幼苗發(fā)芽情況的變化

內(nèi)生菌作為一種促進植物生長發(fā)育、增強宿主抗逆性的天然資源，對鹽脅迫下植物的生長具有顯著促進作用。如龐發(fā)虎等［25］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌可以促進小麥的生長；傅蕾［26］研究發(fā)現(xiàn)象草內(nèi)生菌能夠有效緩解中、低鹽濃度脅迫對雜交狼尾草種子萌發(fā)的毒害作用，對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長度都有顯著的增益和改善作用。在本研究中，旱鹽脅迫下接種短小芽孢桿菌菌劑后，甘草生長指標有不同程度的增長；甘草幼苗發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)均有不同程度增長。

圖6 不同處理甘草幼苗生長指標的變化

圖7 不同處理甘草幼苗中甘草抗氧化指標的變化

圖8 不同處理甘草幼苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

圖9 不同處理甘草幼苗中碳氮代謝酶活性的變化

3.3 菌劑對旱鹽脅迫下甘草抗氧化系統(tǒng)的影響

植物受到環(huán)境脅迫時，首先通過自身系統(tǒng)的特異保護機制來減輕環(huán)境對自身的傷害作用，即促進抗氧化酶類的活性及非酶抗氧化劑（GSH、ASA）的含量。本研究結(jié)果表明，接種短小芽孢桿菌菌劑可顯著提高鹽脅迫下甘草中GSH、AsA含量。已有大量研究表明，接種內(nèi)生菌可以提高大豆、小麥、番茄、玉米等作物的抗氧化酶活性，增強作物清除活性氧的能力，使作物抗鹽性增強，促進植物的生長發(fā)育［27］。張詩婉［28］研究發(fā)現(xiàn)接種植物內(nèi)生菌可以增強GSH-AsA循環(huán)中相關(guān)物質(zhì)的活性，緩解逆境脅迫對水稻的傷害。

3.4 菌劑對旱鹽脅迫下甘草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)是植物抵御逆境的一種重要方式，也是植物在逆境脅迫下誘導保護性應答的一種重要生理機制?？扇苄缘鞍住⒖扇苄蕴鞘侵参镏匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它的升高會提高幼苗對脅迫的耐受能力。研究表明，植物的滲透調(diào)節(jié)能力與抗逆效果存在相關(guān)性，抗逆效果強的植物其滲透調(diào)節(jié)能力也相對較強。周紅艷等［29］研究表明，噴施EM菌劑可促進重金屬鉛脅迫下溝葉結(jié)縷草生長，顯著提高可溶性糖含量、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，增強抗性。而本研究中，接種短小芽孢桿菌菌劑后，旱鹽脅迫下甘草幼苗中可溶性糖顯著增加；可溶性蛋白在鹽脅迫下顯著增加，在干旱脅迫下反而呈下降趨勢。

3.5 菌劑對旱鹽脅迫下甘草碳氮代謝過程中酶活性的影響

碳氮代謝是植物體內(nèi)基本代謝途徑，直接或間接影響著植物產(chǎn)量及其品質(zhì)的形成。研究表明硝酸還原酶活性強弱與植物氮代謝強弱呈正相關(guān)，其活性強，氮代謝旺盛，植物生長旺盛；蔗糖轉(zhuǎn)化酶與植物的生長有密切關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和利用、植物細胞代謝及生長強度的指標［30］。本研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌菌劑可顯著提高干旱脅迫下甘草硝酸還原酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，顯著提高鹽脅迫下蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性，對硝酸還原酶的影響不大。

綜上所述，制備所得短小芽孢桿菌菌劑通過提高抗氧化物質(zhì)含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及調(diào)節(jié)碳氮代謝過程的酶活性，提高甘草的抗旱耐鹽性，進而促進生長。研究結(jié)果為干旱地區(qū)、鹽堿地區(qū)土壤改良和生態(tài)修復提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

單因素結(jié)合正交試驗得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：麥芽糖4.0%，大豆蛋白胨3.0%，KH2PO40.01%，其余為水。單因素結(jié)合響應面優(yōu)化得到最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時間42 h、發(fā)酵溫度34℃、初始pH 7.00、搖床轉(zhuǎn)速230 r/min、接種量2.0%、裝液量100 mL/250 mL。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵工藝下生產(chǎn)短小芽孢桿菌獲得的液體菌劑：有效活菌數(shù)425×108CFU/mL，pH為7-8，顏色為深褐色，有特殊氣味。

菌劑施用于甘草，可提高抗氧化物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及調(diào)節(jié)碳氮代謝酶活性，提高甘草的抗旱耐鹽性，進而促進其生長。