張美君 吳慶 尹翠 王妮 馬曉慶 馬曉霞 曹云娥

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

黃瓜是我國重要的栽培作物，其栽培面積和產(chǎn)量位居世界首位［1］。隨著需求量的增加及栽培面積的不斷擴大，連作現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致土傳病害日益加重。由尖鐮孢黃瓜?；停‵oc）引起的黃瓜枯萎病是影響黃瓜產(chǎn)量的主要土傳病害之一，一般可減產(chǎn)15%-25%，嚴(yán)重時產(chǎn)量減半甚至絕產(chǎn)，已嚴(yán)重制約了設(shè)施栽培黃瓜的可持續(xù)生產(chǎn)［2］。防治黃瓜枯萎病是黃瓜作物種植中亟待解決的重要產(chǎn)業(yè)問題之一。目前生產(chǎn)上的防治方法以化學(xué)防控為主，結(jié)合抗病品種，田間輪作、嫁接等措施達到防治目的，但化學(xué)藥劑的使用易造成病原菌抗藥性的產(chǎn)生、同時還存在農(nóng)藥殘留和生態(tài)環(huán)境破壞等問題［3］。生物防治主要通過有益微生物調(diào)節(jié)植物根部微生態(tài)環(huán)境，修復(fù)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制土傳病原真菌的繁殖，是一種的安全、環(huán)保的防治措施［4］。

蚯蚓糞是蚯蚓消化有機廢棄物進行生物降解而產(chǎn)生的生物有機肥料［5］，具有良好的團粒結(jié)構(gòu)和較高透氣性，被廣泛應(yīng)用于有機肥、土壤改良劑和盆栽基質(zhì)等方面［6］。Ravindran 等［7］研究證明，蚯蚓糞堆肥中含有豐富的細菌、放線菌和真菌，對部分植物病害有一定的抑制作用。而且越來越多的研究表明許多具有開發(fā)前景的抑菌活性物質(zhì)由蚯蚓堆肥微生物產(chǎn)生，其防治土傳病害的作用也逐步成為現(xiàn)階段應(yīng)用研究所關(guān)注的熱點［8］。

目前應(yīng)用于黃瓜枯萎病防治的生防菌大部分都是從土壤或植物根際分離所得，從蚯蚓糞中篩選用于黃瓜枯萎病害的防治研究較少。菌株具有拮抗作用的原因之一是能分泌代謝活性物質(zhì)，同時拮抗作用發(fā)揮強弱的關(guān)鍵是其產(chǎn)量的多少，而培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件是影響其產(chǎn)量的重要因素。鑒于此，以尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌（Foc）為靶標(biāo)菌，從蚯蚓糞中分離篩選獲得一株具有較強抑制尖鐮孢黃瓜?；筒【钚缘慕獾矸垩挎邨U菌WQ-5，通過單因素篩選和響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌株WQ-5培養(yǎng)條件，通過防效試驗驗證拮抗細菌WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型引起的黃瓜枯萎病的防治效果，以期為枯萎病的生物防治提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌株：尖鐮孢黃瓜?；停‵usarium oxyporumf. sp.cucumerinum）編號為37374和尖鐮孢西瓜專化型（Fusarium oxyporumf. sp.niveum）編號為36367的菌種購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；尖鐮孢甜瓜?；停‵usarium oxyporumf. sp.melonis）由寧夏大學(xué)園藝實驗室保存。

菌株篩選來源：蚯蚓糞采集自寧夏萬輝生物環(huán)保科技有限公司蚯蚓養(yǎng)殖園，是由活蚯蚓消解新鮮牛糞所得。有機質(zhì)含量30.6%，氮、磷和鉀含量分別為1.6%、1.3%和1.0%，pH 6.9，水分38.5%。

培養(yǎng)基：LB營養(yǎng)瓊脂和LB肉湯用于拮抗細菌的分離及培養(yǎng)［9］；PDA培養(yǎng)基用于病原真菌的活化及培養(yǎng)［9］；KMB培養(yǎng)基用于拮抗細菌的發(fā)酵［10］。

供試作物：黃瓜（品種為“德爾99”）。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓糞中拮抗細菌的分離及篩選 稱取10 g蚯蚓糞樣品放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，震蕩20 min，獲得蚯蚓糞懸浮液。將懸浮液稀釋后，得到10-4、10-5、10-6系列濃度梯度，然后依次吸取0.1 mL涂布在LB營養(yǎng)瓊脂平板上，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)各異的菌落進行數(shù)次劃線純化，編號并保存于4℃冰箱中備用。

采用平板對峙法在直徑為9 cm的PDA平板中心打孔后將直徑為5 mm的尖鐮孢黃瓜?；涂菸〔≡灧湃肟變?nèi)，把純化后的菌株用無菌牙簽點接至病原菌2.5 cm處，對照為單獨接種病原菌的平板，重復(fù)3次，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于6 d、9 d和12 d時測量病原菌的菌落直徑，并計算抑菌率，抑菌率（%）= 對照菌落直徑-處理菌落直徑/（對照菌落直徑-5）×100［10］。純化、保留抑制效果最佳的菌株。同時測定抑制效果最佳菌株對尖鐮孢西瓜?；涂菸【图忡犳咛鸸蠈；涂菸【囊志Ч?。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 將篩選出的菌株接種于LB平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)特點以及進行常規(guī)革蘭氏染色。菌株的生理生化鑒定參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［11］。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株送至北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司，使用細菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）擴增細菌16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，extaq 0.25 μL，dNTP 2.0 μL，ddH2O 39.75 μL，通用引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃ 30 s預(yù)變性，30個循環(huán)（98℃10 s；55℃ 30 s；72℃ 90 s），72℃ 5 min。反應(yīng)停止后對PCR產(chǎn)物進行回收及測序。在GenBank中進行測序結(jié)果BLAST相似性比對，通過MEGA 7.0的Neighbor-Joining進行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap自檢值設(shè)為1 000，確定該菌株的分類地位。

1.2.3 拮抗菌株的最適培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.3.1 拮抗菌株的培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化：在KMB培養(yǎng)基中原有組分不變的前提下，采用不同的碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、檸檬酸鈉和果糖），濃度為20 g/L，接種量2%（接種液濃度為1×108CFU/mL），裝液量20%，pH 7.0，于30℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后，測定拮抗菌株發(fā)酵液的OD600值；采用不同的氮源（硝酸鉀、酵母粉、氯化銨和尿素）替換KMB培養(yǎng)基的蛋白胨，濃度為20 g/L，培養(yǎng)條件與碳源相同，測定拮抗菌株發(fā)酵液的生長量（OD600）；在KMB培養(yǎng)基中原有組分不變的前提下，采用不同的無機鹽（硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸錳），濃度為1.5 g/L，培養(yǎng)條件與碳源相同，測定拮抗菌株發(fā)酵液的生長量（OD600）。

發(fā)酵條件優(yōu)化：發(fā)酵培養(yǎng)基組分不變，分別在不同接種量（1%-5%）、不同裝液量（10%-50%）、不同發(fā)酵溫度（27-39℃）、不同發(fā)酵初始pH值（5-9）、不同振蕩器轉(zhuǎn)速（150-270 r/min）的條件下，測定拮抗菌株發(fā)酵液的生長量（OD600）。

1.2.3.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗設(shè)計 基于單因素試驗，用OD600作為響應(yīng)值并以酵母粉用量、裝液量和pH為因變量設(shè)計出3因素5水平的響應(yīng)面試驗（表1）。

表1 Central Composite Design試驗設(shè)計的因素與水平

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化前后抑菌效果比較 用抑制菌絲生長速率法［12］測定拮抗菌的抑菌率。將菌懸液1 mL（1×108CFU/mL）接種于LB液體培養(yǎng)基中制備種子液，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后將種子液接入優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在優(yōu)化條件下培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心10 min，0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液后，得到無菌發(fā)酵濾液。取45 mL冷卻至45℃左右的PDA培養(yǎng)基與5 mL的無菌發(fā)酵濾液混勻制成帶藥平板，中間接種病原菌菌餅（d=5 mm），以不加發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基平板為對照，28℃培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測其生長直徑，計算其抑菌率。

1.2.5 拮抗菌株的防效試驗 種子消毒處理完后，待用。制備尖鐮孢黃瓜?；涂菸【咦討乙海?50 mL錐形瓶中加入50 mL PDA液體培養(yǎng)基，接種病原菌，在180 r/min、28℃條件下培養(yǎng)7 d后，用滅菌紗布過濾孢子懸液，再用無菌水稀釋，直到濃度為1×107CFU/mL。拮抗菌株發(fā)酵液的制備：將菌株在優(yōu)化條件下?lián)u瓶發(fā)酵，用無菌水稀釋濃度至1×108CFU/mL。

1.2.5.1 室內(nèi)防效試驗 種子培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗處理：CK1：無菌水；CK2：尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌孢子懸液；T1：拮抗菌株發(fā)酵液；T2：黃瓜枯萎病原菌孢子懸液+拮抗菌株發(fā)酵液，CK1、CK2和T1處理用尖鐮孢黃瓜?；涂菸【謩e浸種30 min，T2處理是先用病原菌孢子懸液浸種30 min，然后用拮抗菌株發(fā)酵液浸種30 min。取直徑9 cm的培養(yǎng)皿，用無菌雙層濾紙覆蓋培養(yǎng)皿底部并注入5 mL無菌水潤濕，每皿均勻地放入10粒種子，每個處理重復(fù)3次［13］。將處理后的培養(yǎng)皿放入設(shè)置為濕度60%，光照/黑暗（16 h/8 h）的光照培養(yǎng)箱內(nèi)。3 d后，測定發(fā)芽率、發(fā)病率；7 d后，計算活力指數(shù)。發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100，發(fā)病率（%）=（發(fā)病的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100，活力指數(shù)=（根長+莖長）×發(fā)芽率［14］。

1.2.5.2 盆栽防效試驗 將消毒、催芽后的種子播種于裝有滅菌基質(zhì)的育苗缽中，待植株長至兩葉一心時，挑選長勢較一致的植株，灌根接種處理液30 mL。處理1：黃瓜枯萎病原菌孢子懸液，處理2：尖鐮孢黃瓜?；涂菸【咦討乙?拮抗菌株發(fā)酵液。每處理10盆，隨機排列。在灌根后第15天調(diào)查和記錄各個處理的病株數(shù)、發(fā)病癥狀，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，病情指數(shù)及防病效果的計算參考呂恒［15］的方法。病情指數(shù)（%）= ∑（各級病株數(shù) × 相對級數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù) × 最高病級代表值）× 100；防治效果（%）=（空白對照病情指數(shù) - 處理區(qū)病情指數(shù)）/對照組病情指數(shù)× 100。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 選擇SPSS Statistics 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及鄧肯氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗；Origin 8.0軟件用于繪圖；16S rRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用MEGA 7.0軟件；響應(yīng)面試驗設(shè)計選用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 蚯蚓糞中拮抗細菌的分離純化

利用稀釋平板法，共分離純化到352株細菌，運用平板對峙法對這352株細菌進行枯萎病菌抑制性試驗，其中56株細菌對尖鐮孢黃瓜?；涂菸【幸种谱饔谩Ｖ貜?fù)試驗獲得9株對尖鐮孢黃瓜?；涂菸【黠@抑制作用的拮抗菌（編號為WQ1-9）。其中WQ-5在6 d、9 d和12 d時的抑菌直徑和抑菌率均高于其他拮抗菌。同時WQ-5對尖鐮孢西瓜專化型枯萎病菌和尖鐮孢甜瓜?；涂菸【簿哂忻黠@的抑制作用，抑菌率分別是51.48%和41.74%（6 d），故將菌株WQ-5作為后續(xù)研究目標(biāo)（表2，圖1）。

表2 9株細菌對尖鐮孢黃瓜?；涂菸【种谱饔玫暮Y選結(jié)果

圖1 菌株WQ-5對尖鐮孢黃瓜?；涂菸【霓卓棺饔?/p>

2.2 拮抗菌WQ-5的鑒定

2.2.1 菌株WQ-5培養(yǎng)形態(tài)特征及生理生化特征 菌株WQ-5在LB平板上培養(yǎng)24 h，其菌落形狀接近圓形且邊緣不規(guī)則，菌落表面干燥、粗糙（圖2-A）。鏡檢后發(fā)現(xiàn)，菌株WQ-5是革蘭氏陽性細菌，形態(tài)呈桿狀，且產(chǎn)芽孢（圖2-B），結(jié)合菌株WQ-5的生理生化測定（表3），初步鑒定拮抗菌WQ-5為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）。

表3 WQ-5菌株的生理生化實驗結(jié)果

圖2 菌株WQ-5在LB平板培養(yǎng)基（A）及光學(xué)顯微鏡下（B）的形態(tài)特征

2.2.2 16S rRNA 基因分子鑒定 將菌株WQ-5基因序列（1 423 bp）提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST相似性比對，登錄號為MN736614，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示，菌株WQ-5與Bacillus amyloliquefaciens一致性達到100%（圖3），生理生化指標(biāo)也與之相符，故菌株WQ-5被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.3 菌株WQ-5的培養(yǎng)條件優(yōu)化

圖3 菌株WQ-5基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分單因素試驗 當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的碳源被果糖代替后，菌株WQ-5的生長量高于其他組，OD600為2.170；當(dāng)?shù)刺鎿Q為酵母粉時效果最好，菌株WQ-5的OD600為2.341；當(dāng)無機鹽使用硫酸鎂時，顯著提高了菌株WQ-5的生長量（圖4）。因此，選用果糖+酵母粉+硫酸鎂作為優(yōu)化培養(yǎng)基組分。

圖4 不同碳源（A）、氮源（B）和無機鹽（C）對菌株WQ-5生長量的影響

2.3.2 發(fā)酵條件單因素試驗 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果如圖5所示。整體來看，對所有發(fā)酵因素而言，菌體生長量呈現(xiàn)“正態(tài)分布”特征，即“兩頭低，中間高”，說明每個發(fā)酵因素均存在一個最適條件。當(dāng)pH為6.0時，生長量最高（圖5-A）。因此，以6.0為最適初始pH；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為210 r/min時菌體生長量最大。繼續(xù)增大搖床轉(zhuǎn)速，菌體自溶，菌體生長量下降。因此，選擇210 r/min作為菌株WQ-6的最適搖床轉(zhuǎn)速（圖5-B）。對WQ-5進行梯度溫度培養(yǎng)，結(jié)果表明菌株生長量在溫度為33℃時獲得最大值（圖5-C）。菌株WQ-5在裝液量為30%時，生長量最大。因此選擇30%作為菌株WQ-5的最適裝液量（圖5-D）。菌株WQ-5的接種量在1%-4%之間，其菌體量隨接種量的增大而增加，4%時菌體量最大。因此選擇4%作為菌株WQ-5的最適接種量（圖5-E）。

2.3.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果 利用中心組合試驗設(shè)計，在單因素基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，以裝液量、酵母粉用量和pH為響應(yīng)變量，OD600為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗（表4），回歸分析結(jié)果如表5。得到回歸方程：Y=2.16-0.14A-0.09B-0.069C-0.047AB-0.042AC+0.091BC-0.27A2-0.32B2-0.32C2?；貧w模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果表明：因素A、B對菌株的生物量影響極顯著（P＜0.01）；因素C、BC影響顯著（P＜0.05），AB、AC影響不顯著（P＞0.05）；A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），證明試驗各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系不是簡單的線性。

2.3.4 最佳條件的確定及驗證實驗結(jié)果 響應(yīng)面圖和等高線圖反映了pH、裝液量和酵母粉用量3個因素的交互作用對菌體量的影響。等高線形狀密集成橢圓形，響應(yīng)面坡度越陡、表示兩因素的交互作用越顯著，而圓形表示不顯著［16］。如圖6所示，酵母粉用量與裝液量對OD600的交互作用顯著（P＜0.05），pH與酵母粉用量和pH與裝液量之間的交互作用不顯著（P＞0.05），與方差分析結(jié)果一致。在上述模型的基礎(chǔ)上，計算回歸方程的極值（Design Expert 8.0軟件），由二次多項回歸方程得出3個因素的最佳值分別是裝液量38.6%、pH 5.8和酵母粉用量18.9 g/L。在上述條件下，預(yù)測的OD600的最大值為2.185。在最佳培養(yǎng)條件下進行3次平行實驗，獲得OD600的平均值為2.214，接近于預(yù)測值，該模型可以良好地反映菌株WQ-5實際的發(fā)酵情況。

圖5 不同初始pH（A）、轉(zhuǎn)速（B）、溫度（C）、裝液量（D）和接種量（E）對菌株WQ-5生長量的影響

表4 Central Composite Design試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4 優(yōu)化前與優(yōu)化后菌株WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的抑制作用

將菌株WQ-5在斜面培養(yǎng)基上活化后分別接種到不同的發(fā)酵培養(yǎng)基（未優(yōu)化/優(yōu)化）中開始發(fā)酵試驗。與優(yōu)化前進行對比，抑菌直徑和抑菌率分別提高了24.8%和抑菌率30.39%（圖7）。

2.5 拮抗菌株對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的防效試驗

2.5.1 室內(nèi)防效試驗 如圖8所示，菌株WQ-5發(fā)酵液處理黃瓜種子的根長、莖長和VI指數(shù)明顯高于清水（CK1）和病原菌（CK2）對照，同時降低了發(fā)病率。與病原菌對照（CK2）處理相比，T2處理的種子發(fā)芽率由20%提高到50%，發(fā)病率由20%降低到0，種子的根長、莖長和活力指數(shù)分別由68.47 mm、23.21 mm和18.34%提 高 到73.26 mm、27.65 mm和50.45%，提高了7.0%、19.09%和175.14%。綜合以上，拮抗菌株WQ-5可以有效降低種子發(fā)病率并提升發(fā)芽率，同時使種子的根、莖加速生長，且提高了活力指數(shù)。

表5 回歸模型方差分析結(jié)果

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖

2.5.2 盆栽防效試驗 盆栽防效試驗結(jié)果表明菌株WQ-5在溫室條件下能有效地防治尖鐮孢黃瓜專化型引起的黃瓜枯萎病的發(fā)生（表6）。培養(yǎng)15 d后，對照組幼苗的發(fā)病率達到74%，施加WQ-5 菌液處理組發(fā)病率為38%，病情指數(shù)下降48.65%，防治效果為51.67%，因此拮抗菌WQ-5有較好的生防潛力。

圖7 發(fā)酵條件優(yōu)化處理對菌株WQ-5抑菌直徑和抑菌率的影響

3 討論

近年來，芽孢桿菌屬因能耐受高溫、強紫外線和干旱等極端環(huán)境已成為理想的生防菌篩選對象［17］。芽孢桿菌屬被研究用來作為生防菌劑防治植株病害的菌種有很多，被報道比較多的是枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［18］、解淀粉芽孢桿 菌（B.amyloliquefaciens）［19］、多 粘 芽 孢 桿 菌（B.polymyxa）［20］和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）等［21］。本實驗室從蚯蚓堆肥中分離篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌WQ-5，平板對峙試驗試驗和防效試驗結(jié)果表明WQ-5對黃瓜枯萎病具有較強的抑制作用。

圖8 菌株WQ-5發(fā)酵液對黃瓜種子根長（A）、莖長（B）、活力指數(shù)（C）、發(fā)芽率和發(fā)病率（D）的影響

表6 菌株WQ-5對尖鐮孢黃瓜專化型枯萎病菌的盆栽防效

代謝產(chǎn)物是生防菌發(fā)揮生物防治作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其產(chǎn)量的高低直接影響生防菌株的應(yīng)用效果［22］。發(fā)酵是獲得大量微生物活性代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)，不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件可顯著影響微生物細胞的生命活動，進而影響菌株代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率［23］。許多研究表明，優(yōu)化生防菌培養(yǎng)液組成成分和培養(yǎng)條件，可以促進菌體的生長量增加，并提高抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量及防效［22，24］。關(guān)于生防菌株解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究報道很多：如梁艷瓊等［25］對解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）JNC2菌株的發(fā)酵條件及最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為初始pH 6.0，發(fā)酵溫度34℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，裝液量為60 mL/250 mL，接種量7%，發(fā)酵時間72 h［25］；最佳培養(yǎng)基為蛋白胨0.4%，酵母粉0.8%，木糖2%，氯化銨0.6%，硫酸鎂0.2%，優(yōu)化后發(fā)酵濾液的抑菌活性顯著提高了32.61%［25］；盧彩鴿等［26］針對番茄灰霉病菌篩選獲得的菌株MH71的最佳產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基組份為玉米粉36.6 g/L，葡萄糖14 g/L，牛肉膏3.2 g/L，蛋白胨7 g/L，碳酸鈣8 g/L，氯化鈉1.33 g/L，K2HPO40.8 g/L和MgSO40.4 g/L［26］；最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，起始 pH 7.0，接種量3%，裝液量100 mL/500 mL，發(fā)酵時間為72 h，優(yōu)化后菌株的抑菌活性提高了37.4%［26］。李娟等［27］采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌LJ1發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵條件為溫度30℃，初始pH 5，轉(zhuǎn)速200 r/min，裝液量50 mL/250 mL；優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，黃豆粉20 g，蔗糖10 g，氯化鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL［27］。優(yōu)化后的菌株LJ1發(fā)酵液對Botrytis cinerea盆栽實驗防效達51.08%。由此可以看出，不同菌株所需的養(yǎng)分組成和發(fā)酵條件存在差異，可能是菌株的來源不同和菌株本身的生物學(xué)特性，每個菌株都有其獨特的營養(yǎng)需求和生長條件，所以其發(fā)酵工藝不能一概而論，但經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化后的菌株其生防效果較之前均有提高，所以需選擇選擇適合菌株自身生長的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件。

響應(yīng)面分析法通過局部試驗回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，得到準(zhǔn)確有效的試驗結(jié)論，能在整個考察區(qū)域上確定各個因素的最佳組合及最優(yōu)響應(yīng)值，可信度高［28-29］。當(dāng)前，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃瓜枯萎病拮抗菌培養(yǎng)條件的報道較少。本研究以菌株WQ-5的生長量作為考量指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面分析法對菌株WQ-5的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件明顯促進了菌體生長量，優(yōu)化后的抑菌直徑和抑菌率較優(yōu)化前分別提高了24.8%和30.39%。種子發(fā)芽和盆栽防效試驗結(jié)果表明菌株WQ-5發(fā)酵液使種子發(fā)病率降低了20%，發(fā)芽率提高了150%，種子的根長、莖長和活力指數(shù)顯著提高，植株病情指數(shù)下降了48.65%，對黃瓜幼苗的防治效果達到了51.67%，說明拮抗菌WQ-5具有較強的生防潛力。但本研究未檢測菌株WQ-5在植株體內(nèi)不同部位的定殖動態(tài)，同時對其防御病害機理未做探究，如其與植株的防御基因表達、酶活性變化等植物誘導(dǎo)抗性的相關(guān)關(guān)系等，這些問題還需進一步研究，從而全面揭示解淀粉芽孢桿菌WQ-5對黃瓜枯萎病的防治機制。

4 結(jié)論

從蚯蚓糞中篩選得到的能有效抑制尖鐮孢黃瓜?；涂菸【霓卓咕闣Q-5，鑒定為解淀粉芽孢桿菌。使用單因素分析結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化該菌培養(yǎng)條件后，得到最佳培養(yǎng)條件為果糖30 g/L，酵母粉18.9 g/L，硫酸鎂3 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L甘油1 g/L，接種量4%，裝液量38.6%，轉(zhuǎn)速210 r/min，溫度33℃，pH 5.8。與優(yōu)化前進行對比，菌株WQ-5的抑菌直徑和抑菌率分別提高了24.8%和抑菌率30.39%。防效試驗表明，菌株WQ-5能有效促進種子生長且提高活力指數(shù)，降低了黃瓜種子和植株的發(fā)病率，使植株的病情指數(shù)下降了48.65%，防治效果為51.67%，生防效果良好。