李培根 要雅倩 宋吉祥 王天琪 周波 王冰 林榕姍

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2. 山東省鹽堿地植物-微生物聯(lián)合修復(fù)工程技術(shù)研究中心，泰安 271018）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是茄科茄屬的一年生草本植物，是繼水稻、小麥、玉米之后第四大糧食作物［1］，自2014年以來，我國馬鈴薯總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)的1/4，種植面積占世界總種植面積的29%［2］。

植物根際促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指有一類存在于植物根際周圍的細菌，該細菌能促進植物對養(yǎng)分的吸收和利用，同時通過激素促進植物生長、成熟，從而達到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的目的［3］。

吲哚-3-乙酸（IAA）是一種能夠作用于植物生長、發(fā)育全過程的一種生長激素，IAA會影響植物細胞的分裂、伸長、分化和種子萌發(fā)、根系的發(fā)育以及營養(yǎng)生長過程［4］。在雙子葉植物中，IAA能夠促進側(cè)根的生成；在單子葉植物中，能夠促進不定根的形成。IAA對植株的響應(yīng)受到光照、重力、植株花期和結(jié)實期的影響，對于植物光合作用、色素的形成、各種代謝物的合成以及抗逆性方面具有重要意義［5］。

本研究從黑龍江采集的馬鈴薯根際土壤中獲得多株具有產(chǎn)IAA能力的菌株如HL379、HL343、HL344等，通過對HL379進行擬南芥促生試驗、馬鈴薯盆栽試驗等促生效果研究，發(fā)現(xiàn)HL379具有明顯的促生能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 2018年10月于黑龍江齊齊哈爾、雙鴨山、大慶等多地區(qū)的馬鈴薯產(chǎn)地采集的馬鈴薯根際土壤，采集時除去地塊表層5 cm浮土，取耕作層土壤，4℃保存。

1.1.2 供試材料 馬鈴薯品種為大豐三號。擬南芥品種為Col-0擬南芥野生型。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

IAA初篩培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g，L-色氨酸0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0［6］。

Salkowski比色劑：50 mL 35%高氯酸中加入1 mL 0.5 mol/L FeCl3。TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基）：胰酪胨15 g，大豆木瓜蛋白酶水解物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH7.3。

MS培養(yǎng)基：大量元素：NH4NO31 650 mg/L、KNO31 900 mg/L、CaCl2·2H2O 440 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4700 mg/L；微量元素：KI 0.83 mg/L、H3BO36.2 mg/L、MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、Na2MnO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg/L、有機成分：肌醇100 mg/L、煙酸0.5 mg/L、鹽酸吡哆醇（維生素B6）0.5 mg/L、鹽酸硫胺素（維生素B1）0.5 mg/L、甘氨酸2 mg/L、瓊脂7 000 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)IAA芽孢桿菌的篩選

1.2.1.1 芽孢桿菌的分離 取1 g土壤樣品，加入至99 mL無菌水中，37℃，180 r/min，震蕩30 min后充分混勻，制作成10-2濃度的土壤懸濁液，后將土壤懸濁液置于80℃水浴鍋水浴20 min。取1 mL稀釋的土壤懸濁液加入至9 mL無菌水中，依次稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6濃度。使用稀釋平板法將稀釋的土壤懸濁液取100 μL涂布至LB固體培養(yǎng)基中涂至LB平板變干，分離土壤中的芽孢桿菌，每個梯度3個平行，至37℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)、顏色、大小不同的菌株進行分離，分離獲得的菌種劃線純化后獲得單菌落，置于LB斜面37℃培養(yǎng)，于4℃冰箱保藏。

1.2.1.2 產(chǎn)IAA芽孢桿菌初篩 將斜面保藏的菌體重新活化至LB固體培養(yǎng)基中以恢復(fù)菌體活性，后用接種環(huán)挑取1環(huán)單菌落接種到含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中。30℃培養(yǎng)48 h。取1 mL發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液滴加在白色陶瓷板中，加入同體積的Salkowski比色劑，混勻，同時取100 μL 20 mg/mL的IAA標準溶液與同體積Salkowski比色劑混合作為空白處理。在常溫避光反應(yīng)30 min后觀察顏色變化。若產(chǎn)生紅色反應(yīng)則說明有IAA的產(chǎn)生且紅色越深說明IAA產(chǎn)量越高。

1.2.1.3 產(chǎn)IAA芽孢桿菌復(fù)篩

（1）IAA標準曲線的制備：取IAA標準品與蒸餾水配置成10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的IAA標準溶液，與Salkowski比色劑1∶1比例混合后，避光常溫靜置30 min，以蒸餾水與Salkowski比色劑混合為空白對照，在OD530處使用紫外分光光度計測得各濃度的吸光度。以IAA濃度為橫坐標以吸光度為縱坐標繪制IAA標準曲線。

（2）IAA含量測定：將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h。取2 mL發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取1mL上清液加入等量的Salkowski比色劑于石英比色皿中，在OD530紫外分光光度計測該菌株的吸光度。將獲得菌株上清液吸光度代入IAA標準曲線獲得該菌株的IAA產(chǎn)量。

1.2.2 產(chǎn)IAA芽孢桿菌生理生化與鑒定

1.2.2.1 細菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》通過菌種在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后觀察菌種的形態(tài)（包括形態(tài)、顏色、邊緣、表面、透明度等，通過對菌種進行革蘭氏染色并用油鏡進行觀察確定菌株類型。對其進行檸檬酸鹽利用、V-P試驗、酶活測定、生長溫度測定。

1.2.2.2 Biolog系統(tǒng)分析 將在LB固體培養(yǎng)基活化好的菌株接種到TSA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，用無菌棉棒蘸取少量菌體，混入IF-B接種液中，使用濁度儀將濁度調(diào)至90%-98%T，接種液倒至V型加樣槽，使用排槍每孔100 μL依次打入GENE Ⅲ板中，反應(yīng)24-36 h后，通過微生物檢定系統(tǒng)進行比對，確定菌屬。通過GENE Ⅲ板對目的菌株進行生理生化鑒定。

1.2.2.3 16S rDNA鑒定 分離得到的菌株通過天根生物科技公司提供的細菌基因組試劑盒進行提取16S rDNA并進行PCR擴增反應(yīng)，擴增引物為細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）與1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；94℃ 60 s；55℃ 60 s；72℃ 90 s；延伸72℃ 10 min循環(huán)30次。PCR擴增完成后通過1%瓊脂糖凝膠檢測是否PCR成功，將獲得的特異性DNA送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，使用mega7.0建立發(fā)育樹并獲得目的菌株親緣遠近關(guān)系。

1.2.3 促生效果實驗

1.2.3.1 擬南芥促生實驗 擬南芥種子用70%酒精消毒40-60 s后，再使用2%濃度的次氯酸鈉浸泡消毒6 min，用無菌水洗滌6-8次，接種到1/2MS培養(yǎng)基中。4℃暗置春化2 d，取出置于24℃光照培養(yǎng)箱中，晝夜比為2∶1。生長7 d后，加入裝有106CFU/L HL379菌體的無菌水，在1/2MS培養(yǎng)基中進行劃線后培養(yǎng)7 d后測量生物量。

1.2.3.2 馬鈴薯盆栽促生實驗 取當季新鮮的大豐三號脫毒馬鈴薯種薯，0.001 g/L赤霉素與0.2 g/L的磷酸二氫鉀浸泡30 min，將馬鈴薯種薯蓋于濕潤的厚紗布保持濕潤催芽7 d后移栽至蛭石與土體積比為1∶1的花盆中，待馬鈴薯出苗后灌入目的菌株發(fā)酵液，濃度稀釋至106CFU/mL，每盆灌根200 mL，空白處理為加入同體積的液體培養(yǎng)基。待生長40 d后測其生物量，測量馬鈴薯植株的株高、鮮重、干重、根總長等促生指標。90 d收獲時測其產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)IAA芽孢桿菌的篩選

從黑龍江齊齊哈爾、雙鴨等地采集的根際土樣中篩選出11株產(chǎn)IAA的芽孢桿菌測得HL379、HL465和HL436的IAA產(chǎn)量較高，其產(chǎn)IAA量分別達到47.8 mg/L、46.5 mg/L和44.8 mg/L。其他產(chǎn)IAA菌種的IAA產(chǎn)量也在10-40 mg/L的產(chǎn)量區(qū)間內(nèi)，也有一定的促生潛力。取產(chǎn)IAA量最高的菌株HL379進行后續(xù)實驗（圖1，圖2）。

圖1 部分菌株產(chǎn)IAA初篩結(jié)果

圖2 部分菌株IAA產(chǎn)量

2.2 產(chǎn)IAA芽孢桿菌的生理生化及分子鑒定

目的菌株HL379在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌體呈白色、菌落圓形，邊緣凸起，表面呈光滑干燥狀態(tài)。經(jīng)革蘭氏染色后油鏡進行觀察，HL379為革蘭氏陽性菌。對HL379進行生理生化檢測，菌株HL379能夠分解利用淀粉、檸檬酸鹽，在接觸酶反應(yīng)和苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)中呈陽性，V-P試驗中呈陰性，符合芽孢桿菌屬生理生化特性（圖3，表1）。

圖3 HL379菌落形態(tài)（左）與革蘭氏染色實驗結(jié)果（右）

表1 HL379菌株生理生化檢測

以HL379菌株的DNA為模板獲得1.4 kb的特異性DNA片段。經(jīng)16S rDNA測序獲得HL379菌株16S rDNA序列，通過在NCBI網(wǎng)站進行Blast序列比對。比對結(jié)果經(jīng)mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

在NCBI通過Blast序列比對得到HL379與阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（MK517594.1）的一致性達到100%，通過建立系統(tǒng)發(fā)育樹顯示HL379與阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（EF114313.2）自展值達到99%，確認HL379菌株為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）（圖4）。

利用Biolog鑒定系統(tǒng)對菌株HL379進行生理生化鑒定，結(jié)果表明HL379菌株能夠利用葡萄糖、果糖等單糖類物質(zhì)，也能利用山梨醇、甘露醇等醇類物質(zhì)（表2）。

2.3 HL379促生效果驗證

圖4 HL379 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 HL379 Biolog生理生化鑒定

2.3.1 擬南芥促生實驗 待擬南芥生長7 d后，測其鮮重、干重、根長。研究表明HL379處理后的擬南芥相對于空白組干重變化不明顯。在根長方面增加了11%但沒有顯著性變化（表3，圖5）。

2.3.2 馬鈴薯盆栽實驗 對40 d的馬鈴薯進行生物量測定發(fā)現(xiàn)，HL379處理過的馬鈴薯植株在株高、鮮重、干重、根總長等方面分別相比于空白組增加了13%、32%、107%、20.8%。鮮重、干重、根總長等方面具有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

表3 擬南芥促生實驗

圖5 擬南芥促生實驗

表4 馬鈴薯生物量測定（40 d）

通過盆栽實驗將施有HL379且生長90 d成熟馬鈴薯的進行產(chǎn)量測定，處理組相比對照組在馬鈴薯產(chǎn)量上增加38%。這說明HL379對馬鈴薯有一定增產(chǎn)效果（表5，圖6）。

表5 馬鈴薯產(chǎn)量（90 d）

圖6 馬鈴薯90 d產(chǎn)量

3 討論

PGPR的作用機制大致分為兩類，一類直接促生作用，另一類為間接促生作用。直接促生作用包括提高植物對營養(yǎng)物質(zhì)的可得性，增強對營養(yǎng)元素如氮源、磷源、鉀源等離子的利用來促進植物的生長及增產(chǎn)［7］；另一方面直接促生作用還包括了一類植物激素等信號因子，如吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素、乙烯等物質(zhì)對植物體生長、果實成熟等方面具有良好的促生作用［8］。另一類為間接促生作用，間接促生包括抑制病原菌的生長、激活自身的免疫系統(tǒng)機制等方面，通過抵御外界病菌的侵害［9］以及激發(fā)植物本身的免疫系統(tǒng)來促進植株生長［10］。

吲哚乙酸（IAA）是一類植物內(nèi)源生長激素，作為信號因子能夠促進植物根系的伸長和增加，從而增加植物養(yǎng)分的攝?。?1］。已報道文獻中發(fā)現(xiàn)多種菌屬具有分泌IAA的能力［12］。自1978年［13］首次發(fā)現(xiàn)細菌能夠產(chǎn)生IAA后，40年來發(fā)現(xiàn)了大量的產(chǎn)IAA菌株，其中以假單胞菌（Pseudomonassp.）［14］、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［15］、克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）為主［16］。目前，我國農(nóng)業(yè)化學(xué)肥料使用量巨大［17］，但化學(xué)肥料使用過度導(dǎo)致的土壤有機質(zhì)含量降低、酸化、土壤板結(jié)等不利影響也逐年加重［18］，因此近年來對于促生菌來促進植物生長越來越受到人們關(guān)注。PGPR在番茄［19］、玉米［20］、水稻［21］等多種作物中檢測出有良好的促生能力。田洪先［22］等報道了利用馬鈴薯內(nèi)生菌來促進馬鈴薯植株的生長及產(chǎn)量的增加，Kesaulya等［23］報道馬鈴薯根際菌株篩選來促進馬鈴薯的生長。

國內(nèi)在馬鈴薯根際細菌方面文獻報道以抗病機制為主［24-26］，而關(guān)于馬鈴薯根際細菌促生效果的研究報道較少。本研究從黑龍江齊齊哈爾篩選出一株產(chǎn) IAA 能 力 較強的菌 株 HL379，其 IAA 產(chǎn) 量 達到 47.8 mg/L。通過馬鈴薯盆栽試驗驗證其促生、增產(chǎn)能力。通過 16S rDNA序列分析結(jié)果結(jié)合 Biolog微生物鑒定系統(tǒng)將其鑒定為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）。

阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）是于2009年首次在印度通過高空采集發(fā)現(xiàn)的新菌種［27］，目前在深海［28］、高原［29］、根際土壤［30］發(fā)現(xiàn)阿耶波多氏芽孢桿菌。同時阿耶波多氏芽孢桿菌在大分子降解［31］、植物促生［32］方面的作用都有所報道。

近年來，阿耶波多氏芽孢桿菌應(yīng)用在促生抗逆方面的報道較多，楊瑩等［33］通過一株具有解磷抗旱功能的阿耶波多氏芽孢桿菌。劉軍生等［34］篩選出一株具有抗鎘能力的阿耶波多氏芽孢桿菌并對小麥進行驗證發(fā)現(xiàn)其具有明顯的降低土壤中鎘元素的能力。本實驗通過對馬鈴薯根際土壤進行篩選獲得一株IAA產(chǎn)量較高的阿耶波多氏芽孢桿菌，為新型微生物肥料的研發(fā)提供了良好的菌種資源。但該菌在實際生產(chǎn)中最佳生產(chǎn)用量、最佳使用方法以及對土壤中其他微生物群落影響等方面還需進一步探究驗證。

4 結(jié)論

通過對馬鈴薯根際土壤進行篩選，獲得11株產(chǎn)IAA菌株，其中IAA產(chǎn)量最高的菌株為HL379，將HL379鑒定為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）。HL379的馬鈴薯促生盆栽實驗表明其對馬鈴薯有較好的促生結(jié)果。