閔 杰, 曹 丹， 韓 梅

(南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 南京 210037)

楊樹在全球共有100多種，是世界上分布范圍最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種之一[1]。相比于其他速生豐產(chǎn)林樹種, 楊樹有著更高的養(yǎng)分需求量，尤其是氮營養(yǎng)元素[2]。先前有研究表明供氮水平會(huì)調(diào)控根系生長和植物形態(tài)變化，如根系形態(tài)及構(gòu)型的變化[3]、葉片形態(tài)的改變[4]、生物量在地上及地下分配的調(diào)節(jié)[5]等。氮素量的多少直接影響楊樹的材積量與胸徑, 在一定的氮素內(nèi)，它們成正比，但氮素過高會(huì)產(chǎn)生抑制效果。隨著氮素濃度的升高，楊樹木材部分木質(zhì)素含量有下降趨勢[6]，根系生長受到抑制，導(dǎo)致根冠比降低[7-8]。

從AspAT催化的生化反應(yīng)和其在代謝網(wǎng)絡(luò)所處的位置推測，AspAT在植物氮代謝通路中有非常重要的作用，包括：1)跟種子萌發(fā)過程中氮素的轉(zhuǎn)移有關(guān)；2)參與營養(yǎng)器官的氮素代謝循環(huán)和轉(zhuǎn)運(yùn)；3)協(xié)調(diào)氮素從源到庫的再分配；4)與種子的氮充實(shí)和成熟有關(guān)[13]。近年來，科研人員[11-12,15-16]在擬南芥等植物中對AspAT在植物體內(nèi)的功能作用進(jìn)行了廣泛的探索，初步證明AspAT在細(xì)胞內(nèi)參與氮和碳代謝平衡，對作物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成有重大的影響。根據(jù)對擬南芥和其他物種的序列鑒定、聚類分析，AspAT可分為兩大家族：Iα和Iβ，兩者序列相似度為15%左右[17]。Iα包含真核生物中的AspAT，Iβ則包括了原核型的AspAT。原核型的AspAT是雙功能酶，除了具有天冬氨酸酶的功能外，還具有預(yù)苯酸氨基轉(zhuǎn)化酶(PAT，prephenate aminotransferase)的功能[17]。AspAT家族基因至少分布在3個(gè)不同類型的細(xì)胞器中, 包括質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體[11-12, 15]。

本課題組在先前研究[18]中，已在楊樹中鑒定了10個(gè)編碼PtAspAT蛋白的家族基因。然而，這些基因在毛果楊體內(nèi)的生理功能和調(diào)控方式尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對毛果楊幼苗設(shè)立3種不同濃度(0、2和10 mmol/L)氮處理，利用非變性膠的方式測定毛果楊中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶3種類型同工酶在不同組織部分的酶活性差異，同時(shí)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)研究PtAspAT家族10個(gè)基因相應(yīng)的表達(dá)量變化，探討PtAspAT在楊樹缺氮、正常氮和高氮條件下的酶活性和基因表達(dá)變化規(guī)律，以期更深入地了解天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶在楊樹氮代謝過程中的分子機(jī)制，為提高楊樹的氮利用率提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用毛果楊(Populustrichocarpa)的組培無菌苗，并使用含0.1 mg/L IBA的MS 培養(yǎng)基[19]進(jìn)行繼代培養(yǎng)，生長條件為：溫度 25 ℃，16 h/8 h(光照/黑暗)。

1.2 方法

1.2.1 不同氮濃度培養(yǎng)基配制

在基本MS培養(yǎng)基中去除硝酸鉀與硝酸銨，并添加0、1和5 mmol/L的硝酸銨，作為3種不同類型的氮梯度(0、2和10 mmol/L)培養(yǎng)基，對應(yīng)楊樹缺氮、正常氮和高氮處理[20]。

1.2.2 樣本處理

從分化培養(yǎng)基選取高度一致的小苗，轉(zhuǎn)接到MS生根培養(yǎng)基，待根長出1 cm左右，轉(zhuǎn)入各濃度氮處理培養(yǎng)基進(jìn)行氮處理。1個(gè)月后，收集幼葉(YL)、成熟葉(ML)、主莖(S)和根(R)等4個(gè)組織，液氮冷凍研磨并凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

在 SPSS 19.0 中，使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和 Levene′s 檢驗(yàn)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分析和方差齊性檢驗(yàn)。采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，利用 Duncan 新復(fù)極差法檢驗(yàn)處理間差異的顯著性水平(P<0.05)。

1.2.4 總RNA提取及cDNA合成

使用植物總RNA提取試劑盒RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)提取RNA，取1 μg RNA使用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 組織特異性檢測

選擇毛果楊(P.trichocarpa)中UBIC基因(XM_002309363.2)作為內(nèi)參基因，使用Primer3設(shè)計(jì)引物(http://primer3.ut.ee/)，具體見表1。采用TB green Premix ExTaqTM(TaKaRa)試劑盒，在Applied Biosystems StepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)中進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為：Premix ExTaqTM5 μL，10 μmol/L正反引物各0.2 μL，ROX reference Dye(50×)0.2 μL，模板cDNA 5 ng, 加水使反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct方法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.6 非變性膠測定酶活性

樣本制備。參照Brauc等[21]的方法進(jìn)行酶活性測定。在液氮中將樣品研磨成粉末,之后加入2倍體積新鮮制備的提取液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,10%甘油，0.1%Triton X-100和1 mmol/L PMSF)。在4 ℃離心機(jī)以13 000 r/min離心10 min取上清即為酶提取液，通過Bradford 法(碧云天蛋白濃度測量試劑盒：貨號(hào)P0006)測取蛋白濃度，計(jì)算量取40 μg總蛋白進(jìn)行非變性電泳。

表 1 PtAspAT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

電泳及染色。實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳法，其中濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為4%，分離膠體積分?jǐn)?shù)為7.5%。染色底物液為0.1 mol/L的 Tris-HCl (pH 7.5)，0.2 mol/L L-天冬氨酸，0.2 mol/L 2-氧戊二酸，0.1 mol/L硝酸鈣和5 g/L PVP-40，將凝膠放入染色液37 ℃孵育30 min，然后在fast violet blue溶液(2 mg/mL)中溫育直至AspAT酶活性條帶區(qū)被染成紫色帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊PtAspAT蛋白序列比對分析結(jié)果

本課題組前期在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(phytozome v12.1，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中鑒定了10個(gè)PtAspAT家族基因候選成員[18]。對這10個(gè)PtAspAT基因蛋白序列進(jìn)行比對分析(圖 1)，發(fā)現(xiàn)毛果楊10個(gè)PtAspAT有很高的同源性，其中有9個(gè)序列片段高度保守，它們是：1)N(V)KEYLPI；2)QS(C)LSGTGSL； 3)S(Q)PTWGNH； 4)CAHNPTG； 5)PFFDV(S)AYQGF； 6)V(M/I)AQSYS(A)KNL(M)G；7)YA(G)ERI(V)GA； 8)R(L)X2RPMY 和9)K(S)DGRISL(M)。這9個(gè)片段中每個(gè)片段至少包含1個(gè)與磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5‘-phosphate)相互作用或與乙二酸/草酸底物結(jié)合的氨基酸殘基。此外，在PtAspAT1和6中還發(fā)現(xiàn)對應(yīng)擬南芥AtPAT (AT2G22250)基因Thr84, Lys169 和 Arg445的氨基酸殘基，這些殘基在特異性識(shí)別結(jié)合預(yù)苯酸(prephenate)和天冬氨酸底物方面發(fā)揮重要作用[22]。

為進(jìn)一步了解PtAspAT的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用MEGA 7.0的最大相似法為毛果楊10個(gè)PtAspAT蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖2所示，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，10個(gè)PtAspATs可聚集成兩大類，即Iα和Iβ。前者包含真細(xì)菌和真核生物類型的PtAspAT，可以進(jìn)一步分成3組：Iα-A，Iα-B和Iα-C。毛果楊PtAspATs的8個(gè)成員屬于Iα家族，其中3個(gè)成員(PtAspAT3、4和10)屬于Iα-A，3個(gè)成員(PtAspAT2、7和8)屬于Iα-B， 2個(gè)成員(PtAspAT5和PtAspAT9)屬于Iα-C。另外2個(gè)成員(PtAspAT1和PtAspAT6)屬于Iβ家族。結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道[11-12,15,18]，推測這些不同類型的PtAspAT蛋白至少分布在3個(gè)不同的亞細(xì)胞器中，其中Iα-A類型的PtAspAT蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)中，Iα-B類型的在線粒體中，而Iα-C和Iβ類型的則在葉綠體中。

2.2 不同濃度氮處理植物的表型變化

為研究PtAspAT在植物氮代謝過程中的作用，采用不同濃度的氮(0、2和10 mmol/L)對毛果楊幼苗進(jìn)行缺氮、正常氮和高氮處理[20]。在持續(xù)1個(gè)月氮處理后，各氮濃度下植株表型發(fā)生明顯變化。如表2所示，相對于對照組(2 mmol/L的氮濃度)，缺氮(0 mmol/L的氮濃度)處理顯著抑制了毛果楊生物量的積累，對地上與地下鮮重、株高和葉面積的抑制率分別達(dá)到85.588%、80.327%、49.659%和80.367%，但是根冠比顯著提高，增幅率達(dá)到33.710%。隨著氮濃度的提高，高氮(10 mmol/L的氮濃度)也會(huì)對毛果楊產(chǎn)生脅迫，相對于對照組，植株的地上鮮重、地下鮮重、株高、葉面積和根冠比均受到了顯著抑制，抑制率分別達(dá)到56.765%、81.421%、28.968%、76.821%和58.757%。這些都與植物缺氮過氮表型吻合[3-5,8]。

2.3 氮處理對PtAspAT酶活性的影響

為研究PtAspAT酶活性變化規(guī)律，將不同濃度氮處理的毛果楊植物不同組織的酶粗提液進(jìn)行非變性膠酶活性鑒定，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)先前的報(bào)道[16,23]，非變性膠中觀察到的3條主帶，分別對應(yīng)線粒體(Mt)、胞質(zhì)(Cy)和葉綠體(Cp)中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同工酶。從圖3可以看出：在正常供氮情況下線粒體PtAspAT在根和莖中活性很高，但在幼葉和成熟葉中活性很低；相反，葉綠體PtAspAT在葉片(幼葉和成熟葉)中的活性很高，莖中的中等，而在根中的活性極低。胞質(zhì)PtAspAT具有與葉綠體PtAspAT同工酶類似的分布趨勢，但其活性條帶更弱。PtAspAT酶活性譜圖清楚地顯示，不同類型的PtAspAT同工酶表現(xiàn)出不同的特征酶譜模式，暗示它們在功能上有明顯的差異。

在0、2和10 mmol/L不同氮濃度處理后，可以發(fā)現(xiàn)：在缺氮條件下，除成熟葉中3種PtAspAT同工酶酶活性無明顯變化外，在幼葉、莖段和根中酶活性都呈現(xiàn)出顯著的下降，這在幼葉的線粒體PtAspAT，莖和根的胞質(zhì)及葉綠體的PtAspAT同工酶中體現(xiàn)得尤為明顯；在高氮處理下，幼葉中線粒體PtAspAT酶活性顯著降低，胞質(zhì)和葉綠體PtAspAT活性略微下降，在成熟葉中各同工酶酶活性無明顯變化，在莖段和根中，3種PtAspAT同工酶酶活性，尤其是線粒體PtAspAT活性顯著上升。

表2 氮處理對毛果楊植物組培苗生長的影響

黑色框中為PtAspAT高度保守的氨基酸片段(1)～(9)；“#”號(hào)代表原核型AspAT特有氨基酸

該進(jìn)化樹是利用MEGA7軟件采用ML方法構(gòu)建的，bootstrap測驗(yàn)采用1 000次重復(fù)，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表分枝的可信度。Cy：細(xì)胞質(zhì)；Cp：葉綠體；Mt：線粒體

2.4 氮處理對PtAspATs基因表達(dá)量的影響

為進(jìn)一步探討PtAspAT在不同氮濃度條件下的變化規(guī)律，對PtAspATs各基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行qPCR定量分析。從圖4可以看出：在缺氮條件下，除了在幼葉中的PtAspAT2，在成熟葉中的PtAspAT2、6和7以及在根系中的PtAspAT7&9表達(dá)量提高外，PtAspATs各基因在不同組織中的表達(dá)量總體上都呈現(xiàn)出下降的趨勢；在高氮脅迫下，相對于正常氮處理，PtAspAT4、5和6在各組織中表達(dá)量略微下降，PtAspAT1在成熟葉、PtAspAT3和10在幼葉中表達(dá)量都顯著提高。這些結(jié)果表明，低氮主要影響植物線粒體PtAspAT編碼基因(即PtAspAT2和7)的轉(zhuǎn)錄，而高氮?jiǎng)t主要影響細(xì)胞質(zhì)PtAspAT編碼基因(即PtAspAT3 和 10)的轉(zhuǎn)錄。

YL：幼葉；ML：成熟葉；S：莖；R：根；Mt：線粒體；Cy：細(xì)胞質(zhì)；Cp：葉綠體

YL:幼葉；ML:成熟葉；S:莖；R:根。*表示差異顯著性P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001

3 討論與結(jié)論

氮高效利用是植物細(xì)胞、組織、器官和產(chǎn)量建成的關(guān)鍵，然而由于氮高效利用屬于數(shù)量遺傳性狀，涉及的基因多且過程復(fù)雜(包括吸收、運(yùn)輸、同化和再轉(zhuǎn)移等一系列過程)[24]。目前氮高效利用的生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化天冬氨酸和谷氨酸相互轉(zhuǎn)化，為植物氮和碳代謝通路提供原料，是植物氮吸收利用過程中的重要代謝酶[13,18]，因而有必要對其在氮代謝過程中的功能和分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

qPCR結(jié)果(圖4)中，線粒體定位的PtAspAT2和7在低氮處理下表達(dá)量在根、莖、幼葉和老葉各組織總體都呈現(xiàn)出上升，但是線粒體PtAspAT同工酶酶活性在各組織(除老葉無明顯變化)反而都顯著下降(圖3)；在莖段中，在高氮條件下葉綠體定位的PtAspAT5和9表達(dá)量降低(圖4)，但是定位于葉綠體的PtAspAT同工酶酶活性卻增高(圖3)?？梢奝tAspAT同工酶酶活性大小與其對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄本的豐度高低變化趨勢并不總是相同的。前人[25]在玉米N同化相關(guān)的酶編碼基因研究中，也發(fā)現(xiàn)ZmAspAT的mRNA水平與酶活性變化趨勢存在不一致的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相一致。這說明AspAT在植物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，可能有轉(zhuǎn)錄或翻譯后機(jī)制參與。

在N脅迫條件下，毛果楊不同組織(根、莖、老葉和新葉)中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)和酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PtAspAT基因的mRNA表達(dá)量和酶活性大小與植物體氮濃度高低密切相關(guān)，為揭示AspAT在植物生長和脅迫響應(yīng)中的代謝和生理意義奠定了理論基礎(chǔ)。