孫艷，王文祥，陳文翰，劉怡波，陳習瑀，陳思曉，林育萍，鄭備紅*

(1.福建省婦幼保健院，福建醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，福州 350001；2. 福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，福州 350108；3. 福建醫(yī)科大學臨床醫(yī)學部，福州 350108)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)與不孕癥(Infertility)皆是育齡期女性的常見病。EMs與不孕癥之間的因果關系尚存爭議，目前資料顯示，EMs患者中約30%～50%有不孕的表現(xiàn)，不孕癥患者中約30%～50%存在EMs[1-2]。但目前尚缺乏從生物信息學視角系統(tǒng)探討EMs與不孕癥在基因組學、蛋白質(zhì)組學以及相應通路的關聯(lián)。因此，我們整合疾病-基因數(shù)據(jù)庫的信息，尋找兩類疾病的共有靶點與信號通路，以期為EMs與不孕癥的發(fā)病機制、疾病進展與治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究資料

以“Endometriosis”、“Infertility”分別為檢索詞，挖掘5個常用疾病-基因數(shù)據(jù)庫信息，剔除重復出現(xiàn)的基因進行整合，獲得EMs與不孕癥的相關基因、蛋白。

5個常用疾病-基因數(shù)據(jù)庫分別是：①OMIM數(shù)據(jù)庫(https：∥omim.org/)，由約翰斯·霍普金斯大學創(chuàng)建并維護，是收錄了人類基因和遺傳疾病信息的權威數(shù)據(jù)庫[3]；②MalaCards(https：∥www.malacards.org/MalaCards)，是人類疾病數(shù)據(jù)庫，涵蓋了70余個數(shù)據(jù)庫，可將疾病與相關經(jīng)典基因相關聯(lián)[4]；③DisGeNet(https：∥www.disgenet.org/)，是收錄與人類疾病相關的基因和突變位點信息的最大公共平臺之一，目前包含1 134 942 個基因-疾病關聯(lián)[5]；④NCBI，即美國國家生物信息中心，提供對生物醫(yī)學和基因組信息，旗下的gene數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)整合了來自廣泛物種的基因信息，在檢索人類疾病時可將物種限定于“Homo sapiens”[6]；⑤Phenopedia(https：∥phgkb.cdc.gov/PHGKB/startPagePhenoPedia.action)，以疾病為中心，可對關聯(lián)文獻進行基因關鍵詞的頻次統(tǒng)計，隸屬于美國疾病控制與預防中心(CDC)公共衛(wèi)生基因組學和精確健康知識庫(PHGKB)[7]。

二、研究方法

1.富集分析：將兩類疾病的基因分別導入Venn Diagram網(wǎng)站(http：∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，繪制韋恩圖，獲得疾病在5類數(shù)據(jù)庫中的共有基因與獨有基因。Metascape(https：∥metascape.org)用于系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)集，將篩選去重后的兩類疾病的相關基因按照規(guī)定格式進行整理，導入該平臺，選定物種為“Homo sapiens”進行基因富集分析，獲得生物途徑、相關通路與蛋白互作網(wǎng)絡[8]。

2.統(tǒng)計學處理：采用Metascape平臺處理，進行GO/KEGG富集分析，基于超幾何分布獲得P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；并根據(jù)需要將P值轉化為-Log(P)以便比較，數(shù)值越小代表越特異。應用分子復雜檢測算法(Molecular Complexity Detection，MCODE)來識別蛋白互作網(wǎng)絡中緊密相關的蛋白質(zhì)進行聚類構建功能模塊。

結 果

一、EMs與不孕癥的共有基因篩選

1.基因挖掘：選取“Endometriosis”為檢索詞，在5大數(shù)據(jù)庫中挖掘與EMs相關的基因，分別在OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因89個、MalaCards數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因74個、Phenopedia數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因323個、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因1 188個以及NCBI gene數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因626個，去重合并后共計1 482個基因(圖1A)。選取“Infertility”為檢索詞，在5大數(shù)據(jù)庫中挖掘與不孕癥相關的基因，分別在OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因528個、MalaCards數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因72個、Phenopedia數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因729個、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因130個以及NCBI gene數(shù)據(jù)庫中獲得相關基因476個，去重合并后共計1 409個基因(圖1B)。

2.共有基因篩選：取EMs與不孕癥兩類疾病基因數(shù)據(jù)導入Metascape平臺，在基因級別，獲得兩者共有基因366個，將其重疊部分以Circos的方式進一步可視化(圖1C)：在外圈中，紅色代表EMs，藍色代表不孕癥；在內(nèi)圈中，以深橙色著色兩個數(shù)據(jù)集的共存基因，以淺橙色顯示單獨存在一個數(shù)據(jù)集的基因；紫色曲線鏈接相同的基因，藍色曲線鏈接屬于相同的富集基因本體模塊的基因，可見兩類疾病關聯(lián)較為密切。

A：EMs相關基因；B：不孕癥相關基因；C：EMs與不孕癥共有基因篩選圖1 EMs與不孕癥相關基因挖掘及共有基因篩選

二、EMs與不孕癥共同參與的生物過程與信號通路

將366個共有基因同時導入Metascape平臺，選取GO與KEGG數(shù)據(jù)庫，獲得與之相關的GO生物學過程數(shù)為2 967，KEGG通路數(shù)為170，按照-log(P)排名并繪制熱圖，前20包括生殖結構發(fā)育、細胞因子介導的信號通路、癌癥相關通路、細胞增殖的負調(diào)控、類固醇代謝過程、細胞對脂質(zhì)的反應、調(diào)節(jié)激素水平、凋亡信號通路、對有毒物質(zhì)的反應、血管發(fā)育、老化、細胞因子-細胞因子受體相互作用、多細胞生物過程、肌肉細胞增殖、調(diào)節(jié)炎癥反應、淋巴細胞激活、對激素刺激的細胞反應、活性氧代謝過程、節(jié)律過程、炎癥性腸病(圖2A)。進一步分析各模塊之間的關系，從20個聚類中的每個聚類中選擇具有最佳P值的模塊，并限制每個聚類不超過15個，并且合計不超過250個。使用Cytoscape構建網(wǎng)絡圖，其中每個節(jié)點代表一個模塊，相似性>0.3的模塊則通過曲線鏈接，并按其聚類ID著色(圖2B)。

A：基因富集模塊熱圖；B：基因富集模塊關系圖圖2 EMs與不孕癥共有基因富集所得的生物過程與信號通路

三、EMs與不孕癥共有基因構建蛋白互作網(wǎng)絡

在Metascape平臺構建與366個共有基因相關的蛋白質(zhì)的全鏈接互作網(wǎng)絡(圖3A)。因蛋白質(zhì)數(shù)量眾多，故應用分子復雜檢測(Molecular Complexity Detection，MCODE)算法來識別蛋白互作網(wǎng)絡中緊密相關的蛋白質(zhì)進行聚類構建15個功能模塊，并用15種顏色表示，再將各模塊從蛋白互作網(wǎng)絡抽離出來，以顯示組成各模塊的重要基因(圖3B)。

將通路和生物過程富集分析應用于每個MCODE，且按照P值得分保留各個模塊中三個最相關的功能描述(表 1)。

A：相關蛋白互作網(wǎng)絡；B：蛋白聚類構建功能模塊圖3 EMs與不孕癥在蛋白組學層面的關聯(lián)

表1 蛋白互作網(wǎng)絡中各個MCODE的P值得分排名前三的生物學注釋

討 論

EMs與不孕癥在育齡女性中發(fā)病率較高，給社會、婦女帶來了較為嚴重的經(jīng)濟負擔，因此，需要將研究和資源的效用最大化來提高對兩種疾病關系的認識，以便發(fā)展更為有效的治療方法。本研究結果證實，EMs與不孕癥兩類疾病存在著大量的共有基因，而這些基因則參與了大量的生物學過程與信號通路。同時，在蛋白質(zhì)組學層面，共有基因所表達的蛋白質(zhì)可形成蛋白互作網(wǎng)絡，這些共同提示著EMs與不孕癥在基因組學與蛋白質(zhì)組學層面有著密切的關聯(lián)。兩類疾病的共有通路主要集中在生殖結構發(fā)育、細胞因子介導的信號通路、癌癥相關通路、細胞增殖負調(diào)控、類固醇代謝過程等，與所有模塊最相關的三大通路為凋亡信號通路、癌癥相關通路、細胞對激素刺激的反應。選取目前已有一定研究基礎的部分機制查找文獻，進一步理解EMs、不孕癥兩類疾病的共性。

由上述結果分析可知，癌癥相關通路可能在EMs、不孕癥兩類疾病的發(fā)病機制中伴有重要角色。其中，抑癌基因TP53參與EMs、不孕癥共有基因所構建的蛋白互作網(wǎng)絡，在細胞周期調(diào)控、基因組穩(wěn)定性維持、誘導細胞分化和凋亡中都有重要的作用。研究表明，特定的TP53基因多態(tài)性與不孕癥、EMs均有關，并與不孕癥婦女中的卵泡刺激素/黃體生成素比值(FSH/LH)顯著相關[9-11]。而在蛋白質(zhì)組學層面，MCODE 1中PD-1信號通路亦可能是疾病的共同相關發(fā)病機制。近年來，抗PD-1治療在癌癥中的治療作用得到廣泛研究。但新近研究表明，運用免疫檢查點PD-1/PD-L1抑制劑治療腫瘤可能影響內(nèi)分泌功能，存在促性腺激素分泌不足等副作用[12]。國外學者曾研究PD-1和PD-L1與EMs相關的不孕癥之間的關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)88例腹腔鏡手術患者血清和腹腔液中PD-1和PD-L1的表達與非EMs對照組之間具有差異性(P<0.05)，提出血清sPD-L1可將EMs相關的不孕癥區(qū)別于其他病理對照組[13]。

除了癌癥相關通路之外，基因富集的結果亦顯示兩類疾病的共同基因參與了活性氧代謝過程。EMs患者體內(nèi)存在氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡、氧化標記物數(shù)量的增加，缺氧相關調(diào)控網(wǎng)絡可使子宮內(nèi)膜異位細胞進化出包括類固醇生成、血管生成、炎癥和代謝轉換等生存模式，使其在腹膜微環(huán)境得以生存[14]。而不明原因不孕癥患者的腹腔液中可見活性氧高水平表達，抗氧化酶谷胱甘肽含量下降，脂質(zhì)過氧化標志物丙二醛明顯高于抗氧化物含量[15]。一項病例對照研究表明，中重度EMs不孕婦女卵丘細胞中超氧化物歧化酶1基因高表達[16]。另一項臨床試驗初步結果提示，抗氧化劑己酮可可堿可提高EMs不孕婦女腹腔鏡術后6個月的總妊娠率[17]。在氧化代謝過程中，細胞色素P450屬于單加氧酶的一類，參與了生物體內(nèi)的甾體類激素合成過程，值得重點關注。在MCODE 4中，主要為CYP家族相關基因，相關蛋白富集分析獲得結果為細胞色素P450共同參與兩類疾病的發(fā)病。研究表明，非經(jīng)典的細胞色素P450氧化還原酶缺乏癥與女性不孕癥密切相關[18]。CYP19基因編碼的芳香化酶細胞色素P450是催化卵巢雌激素生物合成中的關鍵步驟，CYP19A1表達強度與EMs相關[19]。同時，在中國女性中CYP19 rs700518AA基因型賦予與EMs相關的不孕癥的遺傳易感性，其機制可能是異位子宮內(nèi)膜的CYP19基因所表達的芳香化酶影響排卵，從而導致不孕[20]。

根據(jù)在基因組學與蛋白質(zhì)組學層面的生物信息學分析，EMs與不孕癥存在范圍廣、層次多的復雜關聯(lián)，由富集分析而來的發(fā)病機制部分已得到文獻證實，但仍有許多靶點與信號通路尚需得到進一步實驗證明。通過數(shù)據(jù)庫整合獲得的EMs與不孕癥共有基因與通路，有利于更全面地研究兩類疾病的關聯(lián)，可能成為未來治療兩類疾病的共同藥物的潛在靶點。同時，富集結果提示類固醇代謝過程、硫氨基酸代謝過程、活性氧代謝過程等均參與兩類疾病的發(fā)病過程，但本研究由于缺乏相關疾病代謝組學相關數(shù)據(jù)庫，因此，兩類疾病在代謝組學層面之間的關聯(lián)仍需要在未來通過實驗進一步探索與驗證，以期更加精準地進行臨床治療。