辛玲，趙海豹，周越，侯麗

(國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

哺乳動物的性腺細(xì)胞是抑制素B(Inhibin B，INH-B)分泌產(chǎn)生的主要來源，其分子包含α和β(B型)兩個亞單位，通過二硫鍵結(jié)合成αβB形式[1]。動物體內(nèi)存在INH-B的多種亞基形式，但只有兩者結(jié)合在一起才有生物活性，其含量變化隨年齡有一定的起伏。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，INH-B在小鼠睪丸和腦組織中均含量豐富，尤其睪丸中的INH-B水平與小鼠周齡有一定的相關(guān)性，并且α、βB兩個亞基抗體識別蛋白條帶在不同周齡不同組織中的分布存在差異[2]，激發(fā)我們對腦組織中亞基來源及變化的研究興趣。本研究通過分析去勢小鼠與正常對照小鼠的血清和腦組織勻漿上清中INH-B水平變化以及腦組織中INH-B亞基定位分布差異，進(jìn)一步了解INH-B分子的分泌來源，為生殖性腺軸中的INH-B分子調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：4周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠24只，其中去勢小鼠(睪丸切除)12只，正常小鼠12只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(京)2016-0006)。小鼠在可控的條件下給與充足的水和食物，自由進(jìn)食，光照時間8：00～20：00，溫度為24℃±1℃。本研究獲得國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2.主要試劑：兔多克隆抗體Anti-inhibin beta B抗體(NBP2-16966，Novus，美國)；兔單克隆抗體Anti-inhibin alpha抗體(ab216969，Abcam，英國)；熒光(CY3)標(biāo)記羊抗兔IgG(BA1032，武漢博士德生物)；濃縮型正常山羊封閉血清(AR1009，武漢博士德生物)；DAPI(C1002，碧云天)；抗熒光淬滅封片劑(0100-01，Southernbiotech，美國)；Inhibin B 定量檢測試劑盒(ELISA法)(KR-INH B-001，廣州康潤科技)。

3.主要儀器：勻漿儀(IKAT25 digital ULTRA-TURRAX，美國)，酶標(biāo)儀(Wellscan MK 3，Thermo Fisher，美國)，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡(日本)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.小鼠腦組織灌注及處理：兩組小鼠分別在8周齡及12周齡時，通過腹腔注射10%水合氯醛(0.1 ml/只)麻醉狀態(tài)下進(jìn)行解剖處理。完全麻醉后，小鼠固定在解剖板上，打開胸腔暴露心臟，將連接生理鹽水的輸液器穿刺插入心尖搏動處，調(diào)整液體速度50滴/min，在心臟右心耳處用眼科剪剪一小口，并迅速收集流出的血液于1.5 ml的離心管中，置于冰上。待右心房流出的液體清亮且肝臟顏色變白時更換為4%多聚甲醛進(jìn)行灌注，觀察小鼠狀態(tài)，尾部伸直變僵硬表明灌注成功，隨即斷頸后取出腦組織置于4%多聚甲醛保存液中進(jìn)行固定。

2.腦組織蛋白提取及血液處理：僅經(jīng)過上一步驟生理鹽水灌注處理的小鼠，取出腦組織并稱重，放于2 ml的離心管中，置于冰上。按重量∶體積=1 g∶1 ml的比例加入組織裂解液，在冰浴條件下經(jīng)高速勻漿器進(jìn)行組織勻漿，勻漿混合液12 000g離心15 min，吸取上清液，分裝保存在-20℃中備用。收集的小鼠血液在4℃條件下 2 000g離心15 min，吸取上層血清保存在-20℃中備用。

3.小鼠血清及腦組織中INH-B蛋白含量測定：取25 μl的血清或者腦組織勻漿上清液加入酶標(biāo)板中，參照Inhibin B ELISA試劑盒中的操作說明進(jìn)行，顯色后加入終止液，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，利用試劑盒中的A～F號標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線計算樣品中的INH-B蛋白濃度。

4.免疫熒光：腦組織常規(guī)石蠟包埋切片。切片脫蠟后加適量的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)修復(fù)液采用微波進(jìn)行抗原修復(fù)10～15 min，PBS 沖洗3次，每次3 min，滴加稀釋好的山羊血清封閉30 min，甩去多余液體，滴加稀釋好的一抗(1∶100稀釋)于4℃濕盒中孵育過夜。PBST沖洗一抗孵育后的切片3次，每次3 min，吸水紙擦干切片后滴加稀釋好的熒光二抗(1∶100稀釋)，濕盒中37℃孵育1 h，結(jié)束后PBST沖洗4次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST沖洗4次，每次3 min，洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行切片的全景掃描，CaseViewer 2.0軟件處理分析圖像。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、去勢小鼠血清及腦組織中INH-B含量的變化

ELISA檢測血清及腦組織勻漿上清中INH-B蛋白水平的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去勢4周后小鼠血清中的INH-B水平急劇下降，在酶標(biāo)儀讀數(shù)時，去勢小鼠血清孔讀數(shù)接近空白對照，根據(jù)INH-B濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各個樣本中INH-B的濃度值，顯示數(shù)值均已低于檢測下限值(4 pg/ml)。統(tǒng)計軟件計算后，去勢組小鼠8周齡(去勢4周)和12周齡(去勢8周)血清中INH-B水平分別為(3.86±0.55) pg/ml和(3.58±0.71)pg/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組同周齡小鼠的(17.73±0.89) pg/ml和(17.18±0.90) pg/ml，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；但同組小鼠兩個時間點(diǎn)血清INH-B水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.01圖1 小鼠去勢后血清INH-B水平變化

去勢組小鼠8周齡(去勢4周)和12周齡(去勢8周)腦組織勻漿上清中INH-B的濃度分別為(126.0±16.8)pg/ml和(121.0±15.7)pg/ml，而對照組同周齡水平分別為(1 374±69) pg/ml和(1 304±93)pg/ml，統(tǒng)計結(jié)果顯示，小鼠去勢后腦組織中INH-B水平顯著下降(P<0.05)，但沒有出現(xiàn)血清INH-B水平接近檢測下限的現(xiàn)象(圖2)。

與對照組比較，*P<0.05圖2 小鼠去勢后腦組織INH-B水平變化

二、去勢小鼠腦組織中INH-B亞基分布變化

通過免疫熒光分別對兩組小鼠腦組織進(jìn)行INH-B的α和βB亞基分布檢測，結(jié)果顯示兩個亞基分子在腦組織中廣泛分布，去勢組腦組織中的整體熒光強(qiáng)度顯著下降，與ELISA定量檢測結(jié)果相一致，而在分布區(qū)域上沒有明顯不同(圖3)。

局部放大圖為箭頭指示區(qū)域圖3 小鼠腦組織中INH-B亞基的免疫熒光結(jié)果圖

討 論

抑制素(INH)首次發(fā)現(xiàn)是在1932年，有INH-A和INH-B兩種分子形式，最初以為是雄性動物睪丸產(chǎn)生的一種非甾體類激素，可調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，并于1985年以后陸續(xù)從豬卵泡液、牛卵巢濾泡液以及羊睪丸液中分離并得到鑒定[3]。INH-B是由α和βB亞基通過二硫鍵連接形成的異源二聚體分子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員，同家族相近的分子還有活化素(Activin，ACT)。ACT和INH在調(diào)節(jié)卵泡刺激素(FSH)分泌上具有相反的作用，ACT-INH-卵泡抑素系統(tǒng)在調(diào)節(jié)FSH-LH分泌上發(fā)揮重要作用，通過內(nèi)分泌以及自分泌或者旁分泌形式參與到體內(nèi)眾多的生殖生理調(diào)控中，也是下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控機(jī)制研究的一個新熱點(diǎn)[4-8]。

雄性性腺細(xì)胞是INH-B的產(chǎn)生來源，血液中INH-B的水平反映了睪丸功能[9]。動物實(shí)驗(yàn)顯示，給去勢大鼠皮下注射正常雄性精漿可以明顯降低血中的FSH，而注射無精子癥患者精漿后血中FSH水平無明顯變化，表明INH-B的入血是通過細(xì)胞分泌到曲精小管管腔液中來實(shí)現(xiàn)的。INH-B的分泌調(diào)節(jié)主要受Sertoli cell影響[10]。性腺切除術(shù)后，體內(nèi)血循環(huán)的INH水平會迅速下降。Scarlet等[11]對不同程度去勢公牛血清中性腺激素水平變化的研究發(fā)現(xiàn)，對成年公牛進(jìn)行不同形式的去勢處理后，正常組公牛和陰囊部分切除組公牛血清中INH-A水平顯著高于去勢組(睪丸切除組及Burdizzo夾去勢組)，但在處理后的不同時間點(diǎn)上INH-A水平變化無顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠去勢4周后，血清中INH-B水平急劇下降，下降至化驗(yàn)的最低檢測閾值，顯著低于同周齡正常組小鼠血清水平，但與去勢8周小鼠血清INH-B水平無顯著性差異，結(jié)果與前述研究報道一致。也證明了雄性動物血液循環(huán)中的INH-B主要來源于睪丸組織。

雄性動物的INH-B分泌入血后有廣泛的組織分布，遍及整個生殖性腺軸[12-13]。我們前期的研究結(jié)果顯示，在小鼠腦組織中INH-B含量豐富[2]，而不同周齡段間的水平無顯著性差異。關(guān)于INH-B轉(zhuǎn)運(yùn)入腦存在一個分子拆分再組裝的機(jī)制假說[14]，即以亞單位小分子狀態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)至腦組織內(nèi)后再在某些因子作用下組裝成完整的二聚體形式。本研究中成年正常組小鼠腦組織中INH-B含量及變化情況均與以往研究一致，去勢組小鼠腦組織中INH-B含量也是呈現(xiàn)顯著性下降，表明腦組織中INH-B分子不能排除也來源于睪丸。另外去勢小鼠腦組織中INH-B蛋白水平?jīng)]有下降到接近于無的狀態(tài)，可能還是與腦組織對INH-B有一定的富集、儲存現(xiàn)象有關(guān)。

基于以往對INH-B來源及分泌的研究，我們初始推測雄性小鼠切除睪丸后，腦組織中INH-B的分布有顯著變化。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果顯示，睪丸切除小鼠腦組織中α和βB亞基的分布與正常對照小鼠相比，熒光信號強(qiáng)度顯著減弱，而區(qū)域分布并無明顯不同，但α和βB亞基兩者的信號強(qiáng)度不完全一致。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中抗體是針對單個亞基的抗體，識別整個家族中的同一游離亞基以及亞基的前體等不同形式。研究報道顯示，與INH功能相反的ACT，來源于性腺外的多種組織，如腦、肝臟、腎臟及胎盤等，在性腺器官切除后，其水平可保持不變或稍有下降[8]。INH-B與ACT-B有共同的βB亞基；有學(xué)者用免疫組化方法研究INH亞單位的免疫反應(yīng)性時表明，各亞單位均有表達(dá)，分布于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)纖維及神經(jīng)核，α亞基的反應(yīng)強(qiáng)度差[13，15]，也在一定程度上解釋了本實(shí)驗(yàn)中兩個亞基免疫熒光的檢測結(jié)果。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測具有活性的完整二聚體INH-B分子，檢測時信號被放大，靈敏度要高于免疫熒光檢測。另外本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)α和βB亞基免疫熒光信號強(qiáng)度不一致的現(xiàn)象，除了基于INH-B亞基分子結(jié)構(gòu)特性的緣故外，也可能與INH-B合成、組裝、分泌及到達(dá)靶器官位置有關(guān)。整體而言，去勢小鼠體內(nèi)的INH-B可維持一個極低水平的狀態(tài)，表明雄性小鼠INH-B主要來源于睪丸，也提示可能存在著睪丸外來源INH-B。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步了解INH-B分子的分泌來源，分析了去勢小鼠與正常對照小鼠的INH-B血清和腦組織勻漿上清中水平差異以及腦組織中亞基定位分布變化，對小鼠腦組織中INH-B的來源及亞基變化進(jìn)行了初步的研究探索。但本研究中對小鼠去勢后觀察檢測時間點(diǎn)的設(shè)置上不夠精細(xì)，觀察時間間隔過長而總時間略短；另外在驗(yàn)證組織定位變化時忽略了同家族中相同亞基或者相似亞基的影響。因此睪丸去勢對腦組織中INH-B的表達(dá)及分布的影響仍然需要深入研究，或許INH-B在腦組織中的特異抗體是一個研究切入點(diǎn)。