張曉華，劉丹丹，鄭晶晶，呂天鳳，林芳，馬藝欣

(許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000)

蜂蜜中許多物質(zhì)為人體代謝所必需的物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞[1-3]。另外，其常作為輔料添加到各類(lèi)食品中，增加食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4-6]。蜂蜜市場(chǎng)需求量大，部分不法商販為了從中獲取暴利，對(duì)蜂蜜進(jìn)行摻假勾兌，用以次充好等不法手段制造質(zhì)量不合格的蜂蜜，嚴(yán)重?cái)_亂了蜂蜜市場(chǎng)。由于摻假蜂蜜和其他形式的冒牌蜂蜜中活性組分的種類(lèi)和含量與蜜源蜂蜜存在較大差異，可以作為蜂蜜地域、蜜源和品質(zhì)鑒別的重要指標(biāo)，用于不同種類(lèi)、不同產(chǎn)地和不同品質(zhì)蜂蜜的甄別研究。但是蜂蜜背景復(fù)雜，活性物質(zhì)種類(lèi)繁多，含量相對(duì)較低，在多種未知干擾物質(zhì)共存的條件下，實(shí)現(xiàn)多酚類(lèi)物質(zhì)的定性定量分析具有一定的困難。近幾年，隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的快速發(fā)展，尤其是多元校正技術(shù)的發(fā)展，可以很好地解決此類(lèi)定性識(shí)別和定量檢測(cè)的問(wèn)題。它通過(guò)“數(shù)學(xué)分離”將重疊的譜圖分辨為各個(gè)純的分析物、干擾物質(zhì)、儀器噪聲以及基線(xiàn)漂移等的譜圖，即所謂的“二階優(yōu)勢(shì)”[7-10]。也就是說(shuō)，在未知干擾物質(zhì)共存的條件下，它可以利用“數(shù)學(xué)色譜”代替“普通色譜或質(zhì)譜方法”，快速、同時(shí)和準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)感興趣分析物的定性和定量分析。目前，這種聯(lián)合策略已在食品、藥品、環(huán)境和化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[11-13]。對(duì)于基于色譜聯(lián)用儀器的定量分析中存在的色譜流出時(shí)間和基線(xiàn)漂移等因素，該方法可以很好地進(jìn)行校正，獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。在本文中，由于蜂蜜中多酚類(lèi)物質(zhì)含量較低，低于色譜DAD檢測(cè)器的檢測(cè)下限，被淹沒(méi)于基線(xiàn)背景中，我們采用靈敏度更高的液相色譜串聯(lián)單級(jí)質(zhì)譜儀采集蜂蜜樣本中多酚類(lèi)物質(zhì)的“色譜-質(zhì)譜-濃度”三維數(shù)陣，再利用基于交替三線(xiàn)性分解(alternating trilinear decomposition，ATLD)算法的化學(xué)計(jì)量學(xué)二階校正方法進(jìn)行分辨處理?；凇岸A或高階優(yōu)勢(shì)”，可以很好地分辨得到各個(gè)目標(biāo)組分合理的色譜和質(zhì)譜圖以及準(zhǔn)確的濃度預(yù)測(cè)，實(shí)現(xiàn)蜂蜜復(fù)雜背景與未知干擾物質(zhì)共存下4種多酚類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)、直接、快速、準(zhǔn)確定量分析。另外，本研究方案基于多酚類(lèi)物質(zhì)的定量結(jié)果，利用“簡(jiǎn)單聚類(lèi)”分析方法，實(shí)現(xiàn)了蜂蜜種類(lèi)的鑒別，為蜂蜜的品質(zhì)控制分析提供一個(gè)切實(shí)可行的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用到的4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)香豆酸(p-coumaric acid)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)和白楊素(chrysin)均為色譜純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他試劑也均為色譜純，其中，乙腈和甲醇購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。本實(shí)驗(yàn)所研究的3種蜂蜜由河南卓宇蜂業(yè)有限公司提供。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI)及MassHunter工作站B.08.00)：型號(hào)1290-G6470A，購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司；其他儀器為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂蜜樣品的預(yù)處理

本實(shí)驗(yàn)所研究的3種蜂蜜購(gòu)自許昌市大型超市，通過(guò)以下步驟進(jìn)行預(yù)處理：(1)對(duì)于所研究的3種蜂蜜，分別稱(chēng)取10.00 g左右，并置于50 mL離心管中；(2)加入乙腈提取液，經(jīng)漩渦混合器和超聲波清洗器充分混勻，將所得混合液在4 ℃、10000 r/min條件下離心15 min后，轉(zhuǎn)移上清液于分液漏斗中；(3)對(duì)離心管的沉淀物重復(fù)步驟(2)，混合兩次所得上清液；(4)對(duì)所得上清液利用乙腈飽和的正己烷溶液分兩次進(jìn)行提取，提取后的下層樣品轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶?jī)?nèi)；(5)將樣品提取液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上30 ℃蒸干至殘?jiān)?6)用流動(dòng)相定容至10 mL，過(guò)0.22 μm的濾膜備用。

1.2.2 樣本的配制

用純甲醇配制4種分析物的儲(chǔ)備液，其濃度如下：1.020 mg/mL對(duì)香豆酸、1.090 mg/mL槲皮素、1.070 mg/mL山奈酚和0.1008 mg/mL白楊素。所配制的儲(chǔ)備液儲(chǔ)存在4 ℃的冰箱中備用，不同濃度的工作液用流動(dòng)相(35%乙腈∶65%水，V/V)稀釋相應(yīng)的儲(chǔ)備液所得。

校正樣和驗(yàn)證樣：校正樣是通過(guò)先加入不同體積的工作液，然后用流動(dòng)相稀釋到1 mL而制得，具體濃度見(jiàn)表1。同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)不同濃度水平(低、中、高)的驗(yàn)證樣用來(lái)測(cè)試ATLD-LC-MS方法的準(zhǔn)確性。這些驗(yàn)證樣只包含4種多酚物質(zhì)，不含其他干擾，它們的濃度均在校正樣范圍之內(nèi)。

蜂蜜樣和蜂蜜加標(biāo)樣：本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于每一種蜂蜜，我們?cè)O(shè)置了5個(gè)蜂蜜樣本，各個(gè)樣本所稱(chēng)取的蜂蜜質(zhì)量不同。另外，為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在各個(gè)蜂蜜樣本中添加不同濃度水平的分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液制成加標(biāo)樣，每個(gè)類(lèi)型的蜂蜜，設(shè)計(jì)了5個(gè)加標(biāo)樣本。加標(biāo)樣本中各個(gè)分析物的最終濃度在其線(xiàn)性范圍內(nèi)。注射到色譜系統(tǒng)之前，每個(gè)加標(biāo)樣的處理方式和蜂蜜樣本相同。校正樣、驗(yàn)證樣和蜂蜜加標(biāo)樣中目標(biāo)分析物的濃度見(jiàn)表1。

表1 校正樣、驗(yàn)證樣和蜂蜜加標(biāo)樣中 目標(biāo)分析物的濃度Table 1 The content (μg/mL) of the analytes in calibrated, validated and spiked honey samples

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件

高效液相色譜系統(tǒng)由一個(gè)配有100 μL進(jìn)樣環(huán)的自動(dòng)進(jìn)樣器和一個(gè)安捷倫1290 Infinity系列雙二元泵組成。色譜分離是在Agilent Eclipse Plus C18 RRHD反相液相色譜柱中進(jìn)行(1.8 μm，50 mm×2.1 mm i.d.)。質(zhì)譜檢測(cè)用的是安捷倫G6470系列三重四極桿質(zhì)譜儀，使用電噴霧離子源在負(fù)離子模式下工作。質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置：霧化器壓力40 psi，F(xiàn)ragment電壓220 V，毛細(xì)管電壓4000 V，干燥氣流速8 L/min，干燥氣溫度300 ℃。為了后續(xù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)ATLD方法輔助分析，質(zhì)譜檢測(cè)器在全掃描模式下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍是50～400 amu，間隔0.1 amu，掃描速度0.514 s/cycle。

色譜流動(dòng)相為乙腈∶水35∶65(V/V)，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL，流速為0.3 mL/min。

2 理論部分

LC-MS在全掃描模式下對(duì)單個(gè)蜂蜜樣本分析可產(chǎn)生一個(gè)二維矩陣數(shù)據(jù)，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是由兩個(gè)參數(shù)構(gòu)成：其中一維是保留時(shí)間，另一維為質(zhì)荷比(m/z)，該二維數(shù)陣的大小為I×J(保留時(shí)間×質(zhì)荷比)。通過(guò)對(duì)K個(gè)樣本(包括校正樣、蜂蜜樣和蜂蜜加標(biāo)樣)的多次HPLC運(yùn)行可以收集得到一個(gè)三維數(shù)陣，其大小為I×J×K(保留時(shí)間×質(zhì)荷比×樣本數(shù))。如果每次LC-MS掃描得到的色譜峰無(wú)明顯的色譜保留時(shí)間漂移和基線(xiàn)漂移，那么這個(gè)三維數(shù)陣就符合三線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)陣X 中的每個(gè)元素xijk可以表示為：

(1)

式中：N 代表總因子數(shù)，包括可檢測(cè)到的目標(biāo)組分、背景、儀器噪聲和未校正的干擾物；xijk是X 中的元素，表示樣品k在保留時(shí)間i和質(zhì)荷比j時(shí)的離子流強(qiáng)度；ain、bjn和ckn分別為歸一化色譜矩陣A(I×N)、歸一化質(zhì)譜矩陣B(J×N)相對(duì)濃度矩陣和C(K×N)中的元素；eijk是大小為I×J×K的三維殘差數(shù)據(jù)陣E 中的元素。

ATLD算法由吳海龍教授等于1998年提出[14]，它是基于最小二乘原理基礎(chǔ)上的迭代算法，具有對(duì)組分?jǐn)?shù)不敏感、收斂快速等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ATLD算法能夠在占用最小計(jì)算機(jī)內(nèi)存的情況下以最快速度給出較好的定性和定量分析結(jié)果。所以，本研究工作中，我們選用ATLD算法進(jìn)行目標(biāo)分析物的同時(shí)定性定量分析。關(guān)于該算法詳細(xì)信息此處不再贅述，請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。另外，本文所有的計(jì)算均在Matlab平臺(tái)上進(jìn)行，采用Matlab語(yǔ)言來(lái)編譯算法及相關(guān)運(yùn)行程序。

3 結(jié)果與討論

3.1 多酚類(lèi)物質(zhì)色譜行為分析

圖1 基于LC-MS全掃模式的總離子流圖Fig.1 The total ion current diagram based on LC-MS full scan mode

3.1.1 LC-MS實(shí)驗(yàn)所遇到的問(wèn)題

圖1中A和圖1中B分別為校正樣和驗(yàn)證樣的總離子流圖，圖1中C以椴樹(shù)蜜為例展示了蜂蜜樣和蜂蜜加標(biāo)樣的總離子流圖。由圖1中A和圖1中B可知，4種目標(biāo)分析物的譜圖出現(xiàn)了基線(xiàn)漂移。另外，由于對(duì)香豆酸的流出時(shí)間較短，僅為0.78 min，譜圖上還出現(xiàn)了一些其他儀器噪聲干擾。在實(shí)際蜂蜜樣本中，背景更為復(fù)雜，往往會(huì)含有許多未知和未校正的干擾物，這些干擾物質(zhì)會(huì)在目標(biāo)分析物的出峰時(shí)間段出峰，這一點(diǎn)可以從圖1中C所示的蜂蜜樣和蜂蜜加標(biāo)樣中得到驗(yàn)證。

鑒于蜂蜜背景的復(fù)雜性，要實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物與背景中干擾物質(zhì)的完全分離，則需要非常長(zhǎng)的分析時(shí)間，或者根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全分離，這一難題可以借助先進(jìn)的串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS)得以解決。然而，復(fù)雜且精密的串聯(lián)質(zhì)譜儀器價(jià)格相對(duì)昂貴。而且，基于MS/MS的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方法需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力優(yōu)化各種各樣的串級(jí)質(zhì)譜條件，如碎裂電壓、碰撞能量、定性和定量母離子及子離子等。在本文中，我們利用LC-MS結(jié)合ATLD算法的分析策略，巧妙地借助化學(xué)多元校正的“數(shù)學(xué)分離”這種軟策略來(lái)代替三重四極桿質(zhì)譜儀(Q2)和第三重四極桿(Q3)實(shí)現(xiàn)對(duì)離子的二次選擇功能，在很短的時(shí)間(t<8.00 min)內(nèi)就完成了多酚類(lèi)物質(zhì)的定性定量分析。

3.1.2 非線(xiàn)性因素的考察

由于進(jìn)樣時(shí)間、柱溫、柱壓或流動(dòng)相組成等的改變，色譜分析中常會(huì)出現(xiàn)一些非線(xiàn)性現(xiàn)象：例如峰形改變、基線(xiàn)漂移或者時(shí)間漂移等，將會(huì)影響最終的定性和定量結(jié)果。因此，在使用ATLD算法分析實(shí)驗(yàn)所獲得的三維數(shù)據(jù)矩陣(保留時(shí)間×質(zhì)荷比×樣本數(shù))之前，我們要測(cè)試其是否滿(mǎn)足三線(xiàn)性結(jié)構(gòu)。當(dāng)非三線(xiàn)性因素較為嚴(yán)重時(shí)，分辨結(jié)果將會(huì)出現(xiàn)較大的偏差。由圖1中A可知，5個(gè)校正樣中4種分析物所對(duì)應(yīng)的峰位置基本相同，且每個(gè)峰的形狀也基本相似。因此，我們可以認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)中所采用的色譜和質(zhì)譜的條件相對(duì)穩(wěn)定，4個(gè)目標(biāo)分析物沒(méi)有明顯的時(shí)間漂移，所獲得的LC-MS數(shù)據(jù)基本符合三線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，故可使用ATLD算法來(lái)進(jìn)行定性定量分析。

然而，在一些其他HPLC聯(lián)用實(shí)驗(yàn)中，尤其當(dāng)色譜流出時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，時(shí)間漂移和基線(xiàn)漂移將無(wú)法避免。這種情況下，可以使用其他一些靈活的化學(xué)計(jì)量學(xué)多元校正方法，例如MCR-ALS(multivariate curve resolution-alternating least squares)或者PARAFAC2 (parallel factor analysis 2)等[15-17]。這些方法一般是處理展開(kāi)的三維數(shù)陣，因此對(duì)數(shù)據(jù)的三線(xiàn)性結(jié)構(gòu)沒(méi)有嚴(yán)格的要求，可以很好地處理非三線(xiàn)性數(shù)據(jù)。目標(biāo)分析物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、保留時(shí)間和驗(yàn)證樣的平均回收率見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)分析物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、 保留時(shí)間和驗(yàn)證樣的平均回收率Table 2 The regression equations, correlation coefficients, retention time and average recovery rates of the four target analytes in the validated samples

3.2 ATLD-LC-MS方法的驗(yàn)證

在利用ATLD算法分辨蜂蜜樣本之前，我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)不同濃度水平的驗(yàn)證樣本來(lái)測(cè)試所運(yùn)用ATLD-LC-MS方法的準(zhǔn)確性。這些驗(yàn)證樣本只包含4種目標(biāo)分析物，不含任何其他干擾，并設(shè)計(jì)在校正樣濃度范圍之內(nèi)。

圖2中A1～A4、B1～B4、C1～C4分別展示的是利用ATLD算法分辨得到的驗(yàn)證樣的歸一化總離子流色譜圖、歸一化質(zhì)譜圖及相對(duì)濃度圖。由圖2可知，使用ATLD算法是可行的，成功地解決了色譜峰的基線(xiàn)漂移和儀器信號(hào)的干擾，實(shí)現(xiàn)了4種多酚類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)定量分析。由于ATLD建模不設(shè)置任何約束條件，由圖2中A1～A4可知，總離子流圖中出現(xiàn)了幾個(gè)負(fù)且嘈雜的輪廓(圖中的虛線(xiàn)表示)，可以看作是儀器噪聲或其他非三線(xiàn)性成分。需要注意的是，由于總離子流色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)是歸一化的，組分的強(qiáng)度信息可從相對(duì)濃度矩陣中看出。另外，驗(yàn)證樣的定量結(jié)果見(jiàn)表2，4種目標(biāo)分析物的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)都在0.9900以上，平均回收率接近100%，說(shuō)明本文的ATLD-LC-MS分析策略準(zhǔn)確可行。

3.3 利用ATLD算法實(shí)現(xiàn)蜂蜜樣本中4種多酚類(lèi)物質(zhì)的定量分析

本部分內(nèi)容將基于ATLD算法的二階校正方法直接用于蜂蜜樣本中多酚類(lèi)物質(zhì)的定量分析。由于蜂蜜背景基質(zhì)異常復(fù)雜，很難客觀地預(yù)測(cè)其真實(shí)的組分?jǐn)?shù)，因此本工作中使用核一致方法(core-consistency diagnostic, CORCONDIA)預(yù)估計(jì)體系的組分?jǐn)?shù)[18]。CORCONDIA法是使用頻率較高的組分?jǐn)?shù)的估計(jì)方法之一，利用三維數(shù)據(jù)分解的唯一性，比較PARAFAC模型中超對(duì)角陣T和Tucker3模型的核心矩陣G之間的相似程度來(lái)進(jìn)行組分?jǐn)?shù)的估計(jì)。

表3 蜂蜜樣本中4種多酚類(lèi)物質(zhì)的含量、 平均回收率和相對(duì)偏差Table 3 The content, average recovery rates and relative deviations of the four polyphenols in honey samples

續(xù) 表

圖3分別為分辨得到的洋槐蜜中4種目標(biāo)分析物歸一化的總離子流色譜圖、歸一化的質(zhì)譜圖和相對(duì)濃度圖。

圖3 基于ATLD方法的洋槐蜂蜜樣本中目標(biāo)分析物的 歸一化色譜圖(A1～A4)、歸一化質(zhì)譜圖(B1～B4) 和相關(guān)濃度圖(C1～C4)Fig.3 The normalized chromatogram (A1～A4), normalized mass spectrometry (B1～B4) and relative concentration (C1～C4) of the target analytes in acacia honey samples obtained by ATLD

由圖3可知，對(duì)于實(shí)際的蜂蜜樣品，盡管我們對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行了一些簡(jiǎn)單的前處理，但依舊存在大量未知未校正干擾物與目標(biāo)分析物共流出。如果要實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分與背景中的干擾物完全分離，要么需要很長(zhǎng)的分析時(shí)間，要么前處理極其復(fù)雜。尤其是對(duì)香豆酸，其流出時(shí)間比較靠前，相對(duì)干擾尤為嚴(yán)重，利用ATLD算法進(jìn)行分辨時(shí)，我們選取了10個(gè)組分?jǐn)?shù)才得到了正確的色譜-質(zhì)譜分辨結(jié)果以及準(zhǔn)確的濃度預(yù)測(cè)值。其中，2個(gè)組分?jǐn)?shù)用于模擬蜂蜜中的未知干擾物質(zhì)，7個(gè)組分?jǐn)?shù)用于扣除背景基線(xiàn)和擬合儀器噪聲等。其他兩種蜂蜜(棗花蜜和椴樹(shù)蜜)的分辨結(jié)果與洋槐蜜相似。雖然4種目標(biāo)分析物的流出時(shí)間較短，有很強(qiáng)的儀器噪聲和背景干擾，但是基于ATLD算法，用“數(shù)學(xué)分離”的方法在很短的分析時(shí)間(t<8.0 min)內(nèi)獲得目標(biāo)分析物精準(zhǔn)的定量分析結(jié)果，充分說(shuō)明了本文發(fā)展的ATLD-LC-MS方法用于蜂蜜中的4種多酚類(lèi)物質(zhì)的定性識(shí)別和定量檢測(cè)的分析策略是完全可行的，具有良好的應(yīng)用前景。

對(duì)于每一種蜂蜜樣本，我們?cè)O(shè)置了5個(gè)加標(biāo)樣來(lái)驗(yàn)證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，其定量結(jié)果見(jiàn)表3。由于研究的物質(zhì)和蜂蜜種類(lèi)較多，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，表3中只列出了各個(gè)分析物在各種蜂蜜中的平均回收率。由表3可知，3種蜂蜜中對(duì)香豆酸的加標(biāo)回收率都偏低，分析可能存在的原因主要有3個(gè)方面：(1)基質(zhì)效應(yīng)的影響，為主要影響因素；(2)蜂蜜中其他干擾物質(zhì)共流出的影響，流出時(shí)間靠前的目標(biāo)分析物影響較大；(3)蜂蜜處理方法的影響，前處理后蜂蜜pH值也可能產(chǎn)生一定的影響。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將嘗試進(jìn)一步加大色譜的分離度，嘗試使用二階標(biāo)準(zhǔn)加入法，考慮其他蜂蜜的處理方法，例如過(guò)固相萃取柱等，進(jìn)一步考察相關(guān)原因。

由表3可知，其他3種物質(zhì)(槲皮素、山奈酚和白楊素)的加標(biāo)回收率令人滿(mǎn)意，其值為 86%～112%，這說(shuō)明該分析策略基本可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)蜂蜜中多酚類(lèi)物質(zhì)的準(zhǔn)確定量。3種目標(biāo)分析物在各種蜂蜜中的含量不盡相同，其中，槲皮素含量由高到低排序?yàn)椋簵椈?椴樹(shù)蜜>洋槐蜜；山奈酚含量由高到低排序?yàn)椋簵椈?洋槐蜜>椴樹(shù)蜜；白楊素含量由高到低排序?yàn)椋簵椈?洋槐蜜>椴樹(shù)蜜。由表3可知，白楊素的含量差別最大，高達(dá)8.6倍，為下一步進(jìn)行蜂蜜品種的鑒別奠定了基礎(chǔ)。

3.4 ATLD-LC-MS方法的評(píng)價(jià)

本文通過(guò)選取SEN、LOD和RMSEP等品質(zhì)因子評(píng)價(jià)ATLD-LC-MS方法的性能，結(jié)果見(jiàn)表3。由3表可知，本方法的靈敏度在1.26×105～1.90×106mL/μg之間，說(shuō)明該方法的靈敏度較高。此外，檢測(cè)下限和預(yù)測(cè)均方根誤差范圍分別為7.52×10-5～1.18×10-2μg/mL和1.50×10-3～4.20×10-2μg/mL。考慮到所研究背景的復(fù)雜性以及強(qiáng)濃度的背景干擾，所得結(jié)果基本令人滿(mǎn)意。

3.5 蜂蜜的品種鑒別

由表3可知，不同蜂蜜之間各種多酚類(lèi)物質(zhì)的含量存在顯著的差異。其原因可以歸結(jié)為花源和一些環(huán)境因素(如土壤、季節(jié)、溫度和氣候)等的影響。因此，可以考慮基于多酚類(lèi)物質(zhì)的含量進(jìn)行蜂蜜種類(lèi)的區(qū)分。由于對(duì)香豆酸的定量結(jié)果不盡如人意，而其他3種多酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)果較好，所以，本文采用蜂蜜中槲皮素、山奈酚和白楊素的含量對(duì)蜂蜜的種類(lèi)進(jìn)行了區(qū)分，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 基于ATLD-LC-MS方法的定量結(jié)果 進(jìn)行蜂蜜種類(lèi)的區(qū)分Fig.4 The classification of honey species based on the quantitative results of ATLD-LC-MS

由圖4中可以明顯看出蜂蜜樣本自動(dòng)聚集為3組，分別對(duì)應(yīng)于本工作中所檢測(cè)的3種蜂蜜。盡管實(shí)驗(yàn)中用于分類(lèi)的數(shù)據(jù)有限，基于ATLD方法得到的槲皮素、山奈酚和白楊素的定量結(jié)果，結(jié)合“簡(jiǎn)單聚類(lèi)分析”成功實(shí)現(xiàn)了3種蜂蜜的種類(lèi)區(qū)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明：該分析方法對(duì)于蜂蜜品質(zhì)控制具有一定的理論意義和實(shí)際意義，可以為解決目前蜂蜜市場(chǎng)上品種混亂、品質(zhì)不佳、摻假造假等問(wèn)題提供一定的參考和指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用ATLD-LC-MS方法實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中多酚類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)定性和定量分析，借助于二階校正方法的“數(shù)學(xué)分離”功能簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的“物理或化學(xué)分離”。利用液相色譜單級(jí)質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)了嚴(yán)重未知干擾物質(zhì)共存的條件下，目標(biāo)分析物的定性和定量分析。本文通過(guò)統(tǒng)計(jì)與品質(zhì)因子(SEN、LOD和RMSEP)對(duì)所發(fā)展的ATLD-LC-MS方法的性能進(jìn)行了驗(yàn)證，考慮到所研究蜂蜜背景基質(zhì)的復(fù)雜性，產(chǎn)生了強(qiáng)濃度的背景干擾，結(jié)果基本令人滿(mǎn)意。另外，基于上述定量結(jié)果，成功實(shí)現(xiàn)了蜂蜜種類(lèi)的區(qū)分，區(qū)分效果明顯。該方法進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)后，同樣可適用于蜂蜜摻假的鑒別等。本文發(fā)展的ATLD-LC-MS方法具有快速、精準(zhǔn)、綠色環(huán)保、廉價(jià)和簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分析物的同時(shí)定量分析，為蜂蜜的品質(zhì)控制提供了一定的理論參考。