燕平梅，李安萍

(1.太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù) 創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，太原 030619)

我國是一個(gè)蔬菜生產(chǎn)大國，蔬菜資源豐富。從古至今，蔬菜都是人類賴以生存的食物，在旺季時(shí)，會(huì)有源源不斷的各種新鮮蔬菜生產(chǎn)，但是我國目前蔬菜的產(chǎn)后加工水平相對(duì)比較落后，因此，市場(chǎng)供過于求，大量新鮮蔬菜積壓變質(zhì)的情況經(jīng)常發(fā)生，這不僅造成蔬菜的嚴(yán)重浪費(fèi)，還會(huì)使農(nóng)民種植蔬菜的積極性嚴(yán)重降低。然而，這個(gè)棘手的問題可以通過將一部分新鮮蔬菜腌制發(fā)酵成泡菜這一方法得到緩解。

泡菜的主要原料是各種蔬菜，一般來說，只要是纖維豐富的蔬菜或水果，都可以被制成泡菜，泡菜中富含維生素及鈣、鐵、磷、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。泡菜中含有乳酸，有助于食物的消化吸收，吃泡菜可以增加腸胃中有益的菌，抑制腸道中的致病菌，有防止便秘、增強(qiáng)身體的抵抗力、降低膽固醇等作用[1]。與新鮮蔬菜相比，泡菜具有更加獨(dú)特的風(fēng)味，我國已形成具有地方特色的泡菜，如四川泡菜等。酵母菌對(duì)泡菜獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地以及儲(chǔ)藏有著重要的影響[2]，在利用可發(fā)酵糖方面起有益的作用，但如果對(duì)其發(fā)酵不加以控制，酵母菌的產(chǎn)醇增加會(huì)有損泡菜的風(fēng)味，降低泡菜的口感。泡菜發(fā)酵時(shí)的酵母菌不僅有產(chǎn)醇能力，還有產(chǎn)氣能力、產(chǎn)酸能力和產(chǎn)香能力[3]。酵母菌的產(chǎn)氣能力能使泡菜的質(zhì)地疏松，但如果產(chǎn)氣過多會(huì)使泡菜易膨脹；產(chǎn)酸能力可以改變泡菜的酸度和風(fēng)味，產(chǎn)酸過多會(huì)影響泡菜的風(fēng)味；產(chǎn)香能力也對(duì)泡菜的風(fēng)味極其重要。燕平梅等[4]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒、花椒、生姜、大蒜對(duì)部分酵母菌會(huì)產(chǎn)生抑制作用，因此，可以加入一些辣椒等調(diào)料對(duì)酵母菌進(jìn)行適當(dāng)抑制。雖然我國的泡菜有了很大的發(fā)展，但若與韓國、日本的泡菜產(chǎn)業(yè)相比，我國的泡菜發(fā)展還是比較滯后的[5]。

1999年，Ampe等[6]首次將DGGE技術(shù)運(yùn)用于食品菌群結(jié)構(gòu)的研究，隨后許多科學(xué)家將這一技術(shù)運(yùn)用到泡菜等發(fā)酵食品微生物多樣性的研究中[7]。燕平梅等[8]研究表明PCR-DGGE法可用于發(fā)酵食品如泡菜中微生物系統(tǒng)的研究。尹禮國等[9]用DGGE法分析鹽漬青菜中的真菌，以及分離鑒定青菜中的酵母菌。張先琴等[10]、張鵬[11]采用PCR-DGGE法研究了四川泡菜中細(xì)菌和真菌的多樣性。2008年，Chang Ho-Won等[12]用DGGE法對(duì)泡菜中的細(xì)菌、古菌和真菌進(jìn)行了研究。劉鵬飛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DGGE法是不依賴于微生物的分離培養(yǎng)便能研究微生物中多樣性的工具之一，它具有檢測(cè)極低、有助于發(fā)現(xiàn)新物種[14]、分析速度快及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。非培養(yǎng)法較培養(yǎng)法而言，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)[15]。本實(shí)驗(yàn)采用非培養(yǎng)法直接提取3種不同泡菜中的總DNA，通過PCR-DGGE方法研究泡菜中酵母菌微生物的多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

散稱泡菜250 g(原料：甘藍(lán))，用P1表示；白菜泡菜175 g(原料：白菜)，用P2表示；泡酸菜(原料：芥菜)，用P3表示。

1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒(離心柱型)：天跟時(shí)代公司；PCR Master Mix、NL1-GC、丙烯酰胺/甲叉、過硫酸銨、去離子甲酰胺。

WFH-202B型紫外透色分析儀、DcodeTM凝膠成像系統(tǒng)、Bio-Rad電泳儀 美國Bio-Rad公司；搖床。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 泡菜汁中總DNA的提取

在超凈工作臺(tái)中用濾紙(已滅菌)過濾泡菜汁到16個(gè)2 mL離心管(已滅菌)中，以8000 r/min離心5 min，倒盡上清液，聚集沉淀，再次離心5 min，倒掉上清液，然后按照離心柱型DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，于-20 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA。

1.3.2 酵母菌DNA片段PCR擴(kuò)增

在引物合成公司合成酵母菌上引物和下引物，分別為NL1-GC(cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g)，LS2(att ccc aaa caa ctc gac tc)[16]。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)。

1.3.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變性梯度凝膠的變性劑濃度為35%～60%，電泳后凝膠采用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增26S rDNA 片段，純化后與pGM-T Vector進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將檢測(cè)陽性克隆的送到華大基因公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.3.4 DGGE圖譜多樣性分析

所得圖像用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行多樣性分析，最后可以計(jì)算出其多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù)(R)。

H=-∑(Pi)In(Pi)；D=1-∑(Pi)2；R=S-1/InN。

式中：S為某一泳道總條帶數(shù)，N為某一泳道所有峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取結(jié)果

總DNA提取后的電泳圖見圖1，從左到右依次是P1、P2、P3。DNA含量較少，但是純度高，可以做PCR擴(kuò)增。

圖1 總DNA電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of total DNA

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

酵母菌DNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖2，從左到右依次是Marker、P1、P2、P3，其大小在200～300 bp之間。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of PCR amplified product

由圖2可知，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，且是目標(biāo)條帶，因此可以做DGGE。

2.3 DGGE結(jié)果分析

DGGE結(jié)果見圖3。

圖3 泡菜樣品的DGGE電泳圖Fig.3 The DGGE electrophoresis of pickle samples

根據(jù)變性梯度凝膠電泳的分離原理，圖中P1-1、P2-1、P2-2、P2-3、P3-1、P3-2 6個(gè)條帶，其中P1-1、P2-3、P3-2 3個(gè)條帶處于同一高度，代表同一種酵母菌；P2-1和P3-1處于同一高度，也屬于同一種酵母菌；P2-2代表1種酵母菌。由此可知，這3種泡菜中共有3種不同的酵母菌。將這些條帶進(jìn)行回收測(cè)序，并與標(biāo)準(zhǔn)核酸基因庫進(jìn)行比對(duì)，可鑒定DGGE圖中這些條帶所對(duì)應(yīng)的酵母菌，從而分析出泡菜中酵母菌的種類。

2.4 對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行多樣性指數(shù)分析

利用Quantity One軟件分析P1、P2、P3的多樣性指數(shù)，結(jié)果見表1，得到的Relative Qty再除以100才為Pi值， 根據(jù)公式，計(jì)算多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù)(R)。

表1 泡菜中微生物DGGE條帶多樣性分析Table 1 The diversity analysis of microbial DGGE bands in pickles

2.5 聚類分析

運(yùn)用Quantity One軟件對(duì)3種泡菜中真菌酵母菌種類進(jìn)行相似性聚類分析，泡菜中酵母菌的DGGE指紋圖譜聚類分析結(jié)果見圖4。

圖4 泡菜中酵母菌的DGGE指紋圖譜聚類分析圖Fig.4 The DGGE fingerprint cluster analysis of yeast in pickles

結(jié)果顯示：3種泡菜聚為一類，說明酵母菌大致屬于同一類群。P2和P3的相似度為74%，P1與P2、P3的相似度為64%。

2.6 回收DGGE條帶的鑒定

為了研究泡菜中的微生物種類，實(shí)驗(yàn)中回收亮度強(qiáng)的電泳帶，通過對(duì)回收序列進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank庫序列對(duì)比鑒定。經(jīng)鑒定,P2-2、P3-1、P1-1與Candidatropicalis，Pichiafermentans，Saturnisporamendoncae的相似度分別為95%、89%、95%,見表2。

表2 泡菜酵母菌DGGE條帶序列結(jié)果Table 2 The sequence of DGGE bands of yeast in pickles

通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖5。

圖5 泡菜中酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of yeast in pickles

由圖5可知，P3-1、P2-2、P1-1的親緣關(guān)系比較近，為76%，Candidatropicalis和Saturnisporamendoncae這兩種酵母菌的親緣關(guān)系為100%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用非培養(yǎng)法直接采用PCR-DGGE技術(shù)鑒定分析泡菜中酵母菌的多樣性，采用非培養(yǎng)法可以避免傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的局限性，具有重復(fù)性好、成本低、鑒定快速穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。前人對(duì)泡菜中酵母菌的研究認(rèn)為，泡菜中細(xì)菌種類較多，真菌種類較少，張鵬從泡菜中分離得到2株酵母菌；張先琴等對(duì)四川發(fā)酵泡菜中微生物的研究表明，四川泡菜中的真菌有熱帶假絲酵母、漢遜德巴利酵母、奧默柯達(dá)菌和一些非培養(yǎng)的真菌；尹禮國等研究表明，在鹽漬青菜中分離出10種酵母菌，有4種優(yōu)勢(shì)菌與假絲酵母屬(Candida)[17]、德巴氏酵母屬(Debaryomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces) 的菌株相似；曾駿等[18]從四川泡菜中分離到1株畢赤酵母菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：這3種泡菜中共含有3種不同的酵母菌，分別是畢赤酵母菌(Pichiafermentans)、熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)、Saturnisporamendoncae，這與前人的研究結(jié)果有很大的相同之處，也有少許不同之處。

目前，PCR-DGGE技術(shù)已被廣泛運(yùn)用到微生物分子生態(tài)系統(tǒng)的研究中，如土壤、海洋等[19]。該技術(shù)有快速、準(zhǔn)確、易操作等優(yōu)點(diǎn)，最大的優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)出許多不可培養(yǎng)的菌株，但是也有一定的局限性，如該技術(shù)在分析細(xì)菌基因表達(dá)水平、代謝特征及細(xì)菌數(shù)量等信息時(shí)尚有不足；再如DNA條帶的共遷移現(xiàn)象。近年來，許多研究者將這一技術(shù)與其他方法結(jié)合起來進(jìn)行研究，如可以和傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合，或與雜交技術(shù)結(jié)合[20]。