賈 錚，李 蘭，趙根龍，周 劍，肖志明，李 陽，樊 霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京），北京 100081）

喹噁啉類化合物（Quinoxaline，QELs）是一類具有抗菌活性的物質(zhì)，代表性藥物主要有喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹和喹烯酮，均屬于化學(xué)合成喹噁啉-1，4-二氧化合物[1]，自20 世紀(jì)70 年代以來已被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中[1]。隨著人們對(duì)喹噁啉類化合物認(rèn)識(shí)的深入，其毒性作用對(duì)動(dòng)物帶來的損害以及造成食品安全的風(fēng)險(xiǎn)越來越受到廣泛的關(guān)注[2]。2017 年“3.15”媒體曝光了部分廠商存在超范圍、超劑量使用藥物飼料添加劑，其中喹乙醇榜上有名。為配合農(nóng)業(yè)行政主管部門迅速、有效地打擊飼料生產(chǎn)和養(yǎng)殖環(huán)節(jié)違法使用喹噁啉類獸用抗菌藥物的行為，有必要對(duì)飼料中此類藥物檢測方法的不確定度進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)定，以提高測量的準(zhǔn)確性和精密度，為此類藥物的監(jiān)管提供相應(yīng)的技術(shù)支撐。

喹噁啉類物質(zhì)含量的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[3-4]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）[5-8]，本文參考《化學(xué)分析測量不確定度評(píng)定》（JJF 1135-2005）[9]和《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1-2012）[10]，在采用標(biāo)準(zhǔn)方法《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部2086 號(hào)公告-5-2014）[11]進(jìn)行試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化試驗(yàn)操作步驟，并對(duì)配合飼料中4 種喹噁啉類藥物含量進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，對(duì)檢測方法的不確定度來源、評(píng)價(jià)、合成以及量值結(jié)果進(jìn)行探討，建立該方法的測量不確定度模型，對(duì)方法不確定度進(jìn)行定量計(jì)算，為相應(yīng)檢測數(shù)據(jù)的正確評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 色譜級(jí)乙腈、甲醇、甲酸（Fisher 公司）；鹽酸、二甲亞砜、磷酸二氫鉀均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；HLB 固相萃取小柱（200 mg，6 mL）（美國Waters 公司）；標(biāo)準(zhǔn)品卡巴氧（Carbdox）（純度≥99%）、喹乙醇（Laguindox）（純度≥99%）、喹烯酮（Qaincetone）（純度≥98.5%）（Sigma-Aldrich 公司），乙酰甲喹（Meguindox）（純度≥99.8%）（加拿大TRC公司）。

1.1.2 主要儀器 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Finnigan TSQ Quantum Discovery Max（美國Thermo 公司）、3K15型離心機(jī)（美國Sigma 公司）、Eyela MG-2200 型氮吹儀（東京理化器械株式會(huì)社）、BP310s 型電子天平（賽多利斯公司）、BP211D 型電子天平（賽多利斯公司）、Q2-866 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、SK3300 型超聲清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇各10 mg（精確至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加入20 mL 二甲亞砜使固體溶解完全，之后用乙腈定容至刻度，混勻，轉(zhuǎn)移至試劑瓶，于-20℃冰箱內(nèi)避光保存。作為4 種喹噁啉類獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該溶液中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇濃度均為100 μg/mL，準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL 于100 mL 容量瓶內(nèi)，用乙腈稀釋至刻度作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，該溶液中4 種化合物濃度為1 μg/mL。

1.3 樣品提取 準(zhǔn)確稱取飼料樣品2 g（精確至0.001g），置于50 mL 聚乙烯離心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，取出后放入離心機(jī)以9 000 r/min 離心5 min，收集上清液于50 mL聚乙烯離心管中；按照上述步驟重復(fù)提取1 次，合并提取液，混勻。準(zhǔn)確量取5.0 mL 提取液（為分取液）于10 mL 試管中，60℃下氮?dú)獯抵良s2 mL，加入4.0 mL 0.1 mol/L 磷酸二氫鉀充分溶解，備用。

1.4 樣品凈化 選用6 cc HLB 固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，分別用3 mL 甲醇、3 mL 水活化固相萃取柱，將1.3 樣品提取液過柱，控制過柱速度在1 mL/min 以內(nèi)，以3 mL 0.02 mol/L 鹽酸和3 mL 5%甲醇溶液淋洗固相萃取柱，擠干，以5 mL 甲醇洗脫2 次，收集并合并2次洗脫液，于60℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入20%乙腈溶液1 mL，超聲5 min，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.5 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取空白配合飼料樣品，按1.3～1.4 步驟操作制得1 mL 空白基質(zhì)樣品溶液，分別移取適量的卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，60℃下氮?dú)獯蹈珊?，加? mL 空白基質(zhì)樣品溶液溶解，配制成濃度為200 ng/mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲5 min 溶解殘余物，渦旋1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 液相色譜條件 色譜柱：C18 柱，50 mm×2 mm，2.1 μm，美國Thermo 公司；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；電噴霧電壓：4 000 V；霧化溫度：350℃；輔助氣流速：8 L/min；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：SRM。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型 對(duì)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，采用單點(diǎn)法對(duì)樣品進(jìn)行定量。以試驗(yàn)前處理步驟和儀器條件對(duì)添加一定濃度各化合物的配合飼料樣品進(jìn)行測定，平行測定6 次得到各化合物含量的平均值分別為卡巴氧0.334 mg/kg、乙酰甲喹0.342 mg/kg、喹乙醇0.455 mg/kg、喹烯酮0.379 mg/kg。

試樣中待測物質(zhì)含量X（mg/kg）的計(jì)算公式：

式中，A為試樣溶液中待測藥物的峰面積；As為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測藥物的峰面積；Cs為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測藥物濃度（μg/mL）；V為溶解殘余物的體積（mL）；m為樣品的質(zhì)量（g）；V1為分取液體積（mL）；V2為提取液總體積（mL）。

2.2 不確定度來源分析 從檢測方法可以判斷，引入不確定度因素主要有樣品質(zhì)量、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、檢測儀器、樣品的回收率以及測量重復(fù)性等，各不確定度來源因果關(guān)系見圖1。

圖1 配合飼料中4 種喹啉類獸藥含量測定的不確定來源

各影響因素相互獨(dú)立，且計(jì)算公式中各量值為乘除關(guān)系，因此合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以表征：

2.3 不確定度評(píng)定

2.3.1 樣品質(zhì)量m引入的不確定度 樣品質(zhì)量m引入的不確定度主要包括天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度u1（m）和天平重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u2（m），試驗(yàn)中使用的電子天平鑒定證書給出的重復(fù)性為1 mg，最大允許誤差為5 mg，按均勻分布考慮，6 次樣品稱量的平均值是2.019 g，則校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.2 樣品提取、凈化過程溶液體積V引入的不確定度

2.3.2.1 提取液體積 在環(huán)境溫度為20℃條件下，10 mL移液器吸取10 mL 溶液時(shí)容量允許誤差為±0.6%，則校準(zhǔn)不確定度為：u1（V1000）=α/k=10 000×0.6%/ √—3=34.64 μL，溫度引入的不確定度：提取液為0.1% 甲酸乙腈溶液（4+6），在95%的置信系數(shù)下，溫度引起的體積變化：ΔV=V×液體膨脹系數(shù)×ΔT=7.92×0.002 07×3+0.08×0.001 03×3+12×0.001 37×3=0.098 7 mL，溫度引入的不確定度計(jì)算公式：u2（V1000）=α/k=0.098 7/1.96=50.35 μL；則10 mL 移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由此可以計(jì)算出提取液總體積V2的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（V2）

2.3.2.2 分取液體積 過固相萃取柱的提取液體積 使用了5 mL可調(diào)節(jié)移液器，其不確定度：u1（V5000）=α/k=，溫度引入的不確定度：ΔV=V× 液體膨脹系數(shù)× ΔT=1.98×0.002 07×3+0.02×0.001 03×3+3×0.001 37×3=0.024 7 mL，溫度引入的不確定度計(jì)算公式：u2（V5000）=α/k=0.024 7/1.96=12.6 μL，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2.3 定容體積 定容體積V使用了1 mL 可調(diào)節(jié)移液器，其不確定度：u1（V5000）=α/k=1 000×0.6%/√—3 =3.464 μL，溫度引入的不確定度：ΔV=V×液體膨脹系數(shù)×ΔT=0.80×0.001 80×3+0.20×0.001 37×3=0.005 12 mL，溫度引入的不確定度計(jì)算公式為：u2（V5000）=α/k=0.005 12/1.96=2.61 μL，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因此，樣品在提取、凈化過程中由體積變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 引入的不確定度

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度 由對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查得，卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相對(duì)擴(kuò)展不確定度均為±1.0%，包含因子k=2，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（p）=1.0%/2=0.005；乙酰甲喹的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.3%，包含因子k=2，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度： urel（V3）=0.3%/2=0.001 5。

2.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量m引入的不確定度 包括天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度u1（ms）和天平重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u2（ms），試驗(yàn)中使用的電子天平鑒定證書給出的重復(fù)性為0.05 mg，最大允許誤差為0.05 mg，按均勻分布考慮，則校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3.3 定容體積引入的不確定度 包括容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V100）、溫度引入的不確定度u2（V100）、容量瓶估讀誤差引入的不確定度u3（V100）。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）[12]規(guī)定，100 mL容量瓶的允差為±0.10 mL，按均勻分布考慮，引入的不確定度：u1（V100）=0.10 mL/=0.057 7 mL。

用水對(duì)100 mL 容量瓶進(jìn)行10 次的定容和稱量試驗(yàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06 mL，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u（1V100）

測定時(shí)的試驗(yàn)環(huán)境為23℃，與容量瓶校準(zhǔn)時(shí)的溫度（20℃）相差3℃，乙腈的膨脹系數(shù)（20℃）為0.001 37，在95%的置信系數(shù)下，溫度引起的體積變化：ΔV=V×液體膨脹系數(shù)×ΔT=100×0.001 37×3=0.411 mL，溫度引入的不確定度：u2（V100）=α/k=0.411/1.96=0.209 7 mL；從而得到100 mL 容量瓶的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（V100）=u（V100）/100=0.217/100=0.002 183。

2.3.3.4 稀釋引入的不確定度 根據(jù)《移液器計(jì)量檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）[13]，在環(huán)境溫度為20℃條件下，1 mL移液器吸取1 mL 溶液時(shí)容量允許誤差為±1.0%，則校準(zhǔn)不確定度：u1（V1）=α/k=1 000×1.0%/=5.775 μL。

溫度引入的不確定度計(jì)算公式：u2（V1）=α/k=100×0.001 37×3/1.96=0.209 7 μL。

則1 mL 移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：ure（lV1）=5.779/1000=0.005 779。

100 mL 容量瓶體積的不確定度分析同2.3.3.3 中容量瓶體積不確定度的計(jì)算，得到urel（V100）=0.002 183 mL。

稀釋過程按1:100 稀釋，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

經(jīng)過計(jì)算，得到因標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Cs）=0.010 27，乙酰甲喹urel（Cs）=0.009 103。

2.3.4 重復(fù)性引入的不確定度 測量重復(fù)性引入的不確定度主要受實(shí)驗(yàn)人員的熟練程度、儀器自身性能等因素影響，包括稱量的重復(fù)性、樣品提取和凈化過程中溶液體積變化的重復(fù)性、儀器檢測的重復(fù)性等，均屬于A類不確定度。本試驗(yàn)將6 次平行測定的各組分含量值帶入貝塞爾公式，計(jì)算4 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)偏差、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表1。

2.3.5 添加回收率R 引入的不確定度 由表2 可見，6 次樣品添加回收試驗(yàn)得到的卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇和喹烯酮的添加回收率分別在80.7%～89.5%、80.9%～96.0%、87.2%～94.4%、85.5%～101.3%。

采用t檢驗(yàn)法對(duì)各化合物平均回收率與1.0 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，代入公式t=/－ 1.0//S（R）計(jì)算各化合物t值，與t（0.05,5）=2.015 比較以確定回收率是否計(jì)入含量的計(jì)算中。4 種化合物的t值分別為卡巴氧：t=4.53，乙酰甲喹：t=2.21，喹乙醇：t=2.59，喹烯酮：t=0.82，由計(jì)算結(jié)果可知，卡巴氧、乙酰甲喹和喹乙醇3 種化合物須采用回收率因子R修正結(jié)果。

2.3.5 合成不確定度、擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示 由公式ure（lX）=計(jì)算得到4 種喹噁啉類藥物的合成不確定度，根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評(píng)定》（JJF 1135-2005）中規(guī)定的一般正態(tài)分布、95%的置信區(qū)間對(duì)應(yīng)的k=2，則各化合物的擴(kuò)展不確定度為U=urel××2，從而計(jì)算得到采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定配合飼料中4 種喹噁啉類藥物含量不確定度的結(jié)果，見表3。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定配合飼料中4種喹噁啉類獸藥含量的測量不確定度的評(píng)定結(jié)果表明，影響測量不確定度的主要因素是測量重復(fù)性、添加回收率，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和提取、凈化過程的溶劑體積變化，而樣品稱量過程引入的不確定度較小。因此，在實(shí)際操作過程中可以從試驗(yàn)操作能力、儀器設(shè)備、測量重復(fù)性等方面考慮，通過培訓(xùn)提高操作人員的檢化驗(yàn)水平、增加平行樣測定次數(shù)、定期檢定儀器設(shè)備、保持HPLC-MS/MS 的靈敏度和穩(wěn)定性以及嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等方式，盡量減小測量不確定度，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

表1 含量測定結(jié)果數(shù)據(jù)

表2 回收率測定結(jié)果數(shù)據(jù)

表3 各組分?jǐn)U展不確定度及結(jié)果表示