李思源 ，朱哲坤，王 倩，田俊杰，孟禹璇，郭雙雙,2，王 蕾,2，趙 迪,2，李寶成，侯永清,2*

（1.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

當下我國仔豬普遍采用規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖。仔豬早期斷奶因其具有多種優(yōu)點，被大多數(shù)養(yǎng)殖場所采用。在仔豬斷奶的早期階段，其消化系統(tǒng)和免疫器官發(fā)育不完善，易受到外界不良因素的影響產(chǎn)生應(yīng)激[1]，引發(fā)仔豬腹瀉、免疫力減弱、腸道損傷、能量代謝紊亂、氨基酸代謝吸收水平降低等一系列問題[2-3]，從而威脅仔豬的健康，影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)效益。功能性氨基酸可參與并調(diào)節(jié)仔豬關(guān)鍵代謝途徑[3]，合成防御分子調(diào)節(jié)機體免疫，參與小肽、含氮含硫代謝物的生成[4]，參與調(diào)控三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，影響體內(nèi)氨基酸水平等[5]。目前研究較多的功能性氨基酸有精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、色氨酸、組氨酸、蘇氨酸、亮氨酸等[4-5]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于功能性氨基酸在緩解仔豬斷奶應(yīng)激方面的研究較多[6]，但關(guān)于斷奶仔豬日糧中添加功能性氨基酸復合物的研究鮮見報道?；诠δ苄园被嶂g可能存在協(xié)同作用[7]，本研究團隊前期研究表明，添加1.00% 復合氨基酸可顯著降低仔豬腹瀉率，促進腸黏膜生長[16]。本試驗旨在研究復合氨基酸對斷奶仔豬免疫功能以及腸道能量和氨基酸水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 谷氨酸（G103978，99%）、谷氨酰胺（G105425，99%）、精氨酸（A108220，98%）、甘氨酸（A111465，≥99%）、N-乙酰半胱氨酸（A105420，99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。根據(jù)前期試驗研究結(jié)果確定谷氨酸:谷氨酰胺:甘氨酸:精氨酸:N-乙酰半胱氨酸復合氨基酸的組成和比例為10:4:4:2:1[16]。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計 選用16 頭（21±3）日齡、體重（4.83±0.16）kg 的杜× 長× 大斷奶仔豬，隨機分成2 個處理組（對照組和試驗組），每個處理8 個重復，每個重復1 頭豬。對照組和試驗組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.99%丙氨酸（與試驗組等氮）和1.00%復合氨基酸。試驗期為21 d，在試驗結(jié)束時屠宰取樣。

1.3 試驗日糧與飼養(yǎng)管理 基礎(chǔ)日糧參照 NRC（2012）豬的營養(yǎng)標準配制，其組成及營養(yǎng)成分見表1。

試驗期間豬舍全封閉，進豬前對豬舍和豬籠進行全面清洗和消毒。仔豬在不銹鋼試驗籠中飼養(yǎng)，每籠2 只豬，籠子用擋板隔開，分別飼喂。試驗期間保持豬舍通風良好，室溫維持在22～25℃。自由采食和飲水，定時清掃和消毒豬舍，保持豬舍干凈衛(wèi)生。

1.4 樣品采集 于試驗21 d 早上，將空腹仔豬稱重，然后用添加EDTA 抗凝劑的采血管于仔豬前腔靜脈采血，置于冰上待測。采血后，肌肉注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg BW）將仔豬進行麻醉，15 min 后屠宰。打開腹腔在空腸、回腸中段各取10 cm，刮取腸黏膜，液氮速凍后，保存于-80℃冰箱待測。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 生長性能測定 試驗期間詳細記錄每頭仔豬每天的喂料量以及腹瀉情況。分別于試驗的第1、14、21 天對仔豬進行空腹稱重。計算1～14 d 與15～21 d 仔豬的平均日增重、平均日采食量、耗料增重比以及腹瀉率。

1.5.2 血細胞分類計數(shù) 采用德國Siemens ADVIA?2120i全自動血球分析儀對血液進行分類計數(shù)。檢測白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、紅細胞的數(shù)量、血紅蛋白含量、平均紅細胞體積、紅細胞平均血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度變異數(shù)、血小板含量、血小板平均體積。

1.5.3 回腸黏膜免疫相關(guān)基因的相對表達量分析 回腸黏膜中總RNA 使用RNAiso Plus 試劑盒并參照其說明書方法進行提取。在保證RNA 濃度和純度合格（A260/A280=1.7～2.1，且A260/A230＞2.0）且未降解條件下，根據(jù)PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒的方法進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 后使用SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseHPlus） 進行Real-time PCR。以上所用到的試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。檢測的免疫相關(guān)基因為白細胞介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、干擾素（Interferon，IFN）-α、IFN-β、IFN-γ、趨化因子（C-C 基序） 配體2（C-C motif chemokine ligand-2，CCL2）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、干擾素誘導蛋白-1（Interferninduced protein-1，IFIT1）、黏病毒抗性蛋白-1（Myxovirus resistance-1，MX1）?；虻囊镄蛄幸姳?。基因的相對表達量計算參照Fu 等[8]的方法進行分析。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

1.5.4 空腸黏膜能量狀態(tài)的測定 稱取100～200 mg 空腸黏膜研磨樣，置于預冷的玻璃勻漿器中，加入2 mL預冷1.5 mol/L 高氯酸，冰浴勻漿，然后離心（4℃，3 000 g/min，10 min），取上清液1 mL 緩慢加入0.4 mL 2 mol/L 碳酸鉀溶液中和，再離心（4℃，3 000 g/min，10 min），取上清液用高效液相色譜儀（Waters，美國）進行測定。

表2 基因引物序列

根據(jù)洗脫峰面積和標準品濃度，計算空腸黏膜三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate，AMP）的含量，結(jié)果以μg/g 黏膜重表示，并根據(jù)公式計算腺苷酸池（Total Adenosine pool，TAN）、能荷（Energy Charge，EC）、AMP/ATP 值。TAN=ATP+ADP+AMP；EC=（ATP+1/2ADP）（/ATP+ADP+AMP）。

1.5.5 空腸黏膜游離氨基酸的測定 準確稱取空腸黏膜組織樣品150 mg，加1 mL 3%磺基水楊酸溶解。充分渦旋混勻，10 000 r/min 離心15 min，取上清液用鋰鹽樣品稀釋液進行稀釋，再用0.22 μm 孔徑濾膜過濾，用德國SYKAM S-433D 型氨基酸分析儀對濾液中的氨基酸含量進行檢測。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)使用平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t 檢驗分析。以P＜0.01為差異極顯著性判斷標準，以0.01 ≤P＜0.05 為差異顯著判斷標準，以0.05 ≤P＜0.1 為具有差異顯著性趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合氨基酸對斷奶仔豬生長性能的影響 由表3 可知，與對照組相比，試驗組降低了1～14 d 和15～21 d斷奶仔豬的腹瀉率（P＜0.05）；有降低15～21 d 斷奶仔豬耗料增重比的趨勢（P=0.054）。復合氨基酸對各階段平均體重、平均日采食量與1～14 d 耗料增重比無顯著影響。

表3 復合氨基酸對斷奶仔豬生長性能的影響（n=8）

2.2 復合氨基酸對斷奶仔豬血細胞分類計數(shù)的影響 由表4 可知，與對照組相比，試驗組仔豬血液中白細胞、單核細胞的水平顯著降低，極顯著提高了血紅蛋白含量；有降低血液嗜堿性粒細胞含量的趨勢（P=0.064）。復合氨基酸對其他各項血細胞指標無顯著影響。

表4 復合氨基酸對斷奶仔豬血細胞計數(shù)的影響（n=8）

2.3 復合氨基酸對斷奶仔豬回腸黏膜免疫相關(guān)基因表達量的影響 由表5 可知，與對照組相比，試驗組仔豬回腸IFN-β和IFN-γ的基因相對表達量極顯著升高；MX1和IFIT1基因的相對表達量極顯著下降。復合氨基酸對IL-1β、IL-6、CCL2、TNF-α、IFN-α的基因相對表達量無顯著影響。

表5 復合氨基酸對斷奶仔豬回腸黏膜免疫相關(guān)基因表達量的影響（n=8）

2.4 復合氨基酸對斷奶仔豬空腸黏膜能量狀態(tài)的影響 由表6 可知，與對照組相比，試驗組仔豬空腸黏膜TAN 水平顯著升高，有提高空腸AMP 和ATP 的趨勢（P=0.081，0.058）；復合氨基酸對空腸ADP 含量、AMP/ATP、EC 無顯著的影響。

表6 復合氨基酸對斷奶仔豬空腸黏膜能量狀態(tài)的影響（n=8）

2.5 復合氨基酸對斷奶仔豬空腸游離氨基酸含量的影響由表7 可知，與對照組相比，試驗組仔豬空腸精氨酸與瓜氨酸的含量顯著升高；復合氨基酸對其他氨基酸水平?jīng)]有顯著影響。

3 討 論

3.1 復合氨基酸對斷奶仔豬生長性能的影響 功能性氨基酸可以提高斷奶仔豬的生長性能，增強營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力改善其健康狀況[5]。既往研究表明，谷氨酰胺添加量在1.0%左右[3]、谷氨酸添加量在1.3%～1.5%或2.6%～2.9%時對35 日齡仔豬生長性能的提升與腹瀉的改善較為明顯[9]。印遇龍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度精氨酸能夠提高斷奶仔豬的生長性能、降低腹瀉率，可有效緩解斷奶應(yīng)激。本試驗各功能性氨基酸的添加量相對較低，因此對斷奶仔豬生長性能的改善作用不顯著，但是有效降低了腹瀉率。

表7 復合氨基酸對斷奶仔豬空腸游離氨基酸含量的影響（n=8） nmol/mg

3.2 復合氨基酸對斷奶仔豬血細胞計數(shù)的影響 血液是機體重要的免疫場所，血液中有多種血細胞主要通過分泌細胞因子發(fā)揮免疫保護作用。白細胞是機體內(nèi)參與體液免疫的一類重要的功能性免疫細胞，由淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞組成。正常情況下，各種免疫細胞比例處于動態(tài)平衡，當機體發(fā)生炎癥或者其他疾病時都可能引起免疫細胞數(shù)量的變化[11]。血紅蛋白在氧含量高的地方容易與氧結(jié)合，在氧含量低的地方又容易與氧分離，因為這一特性使得紅細胞具有了運輸氧的功能。當仔豬血紅蛋白濃度低于90 g/L 時即可判定為貧血，因此其濃度的高低也可反映出機體的抵抗能力[12]。研究表明，日糧中添加1.0%谷氨酰胺可有效降低血液中的白細胞與單核細胞的含量[13]；添加60 mg/kg 甘氨酸絡(luò)合物可以升高血液中血紅蛋白的含量，預防仔豬貧血、提高免疫力[14]。而本試驗發(fā)現(xiàn)，日糧中添加1.00%復合氨基酸有效降低了斷奶仔豬血液中白細胞、單核細胞與嗜酸性粒細胞的含量，提高了血紅蛋白的含量，這表明此種復合氨基酸可以有效降低斷奶仔豬的炎癥反應(yīng)和貧血，增強了免疫力。

3.3 復合氨基酸對斷奶仔豬回腸黏膜免疫相關(guān)基因表達量的影響 IFN-β是抗病毒活性最強的藥物，它可以誘導一系列干擾素刺激因子的表達，通過干擾病毒的復制和轉(zhuǎn)錄來抑制其蛋白的翻譯，從而增強免疫發(fā)揮抗病毒的效果[15]。前期研究表明，此種功能性氨基酸復合物可以顯著提高仔豬空腸IFN-β基因的相對表量[16]，與本次試驗在回腸中IFN-β基因的相對表量變化趨勢一致。IFN-γ是二型干擾素，有很強的免疫調(diào)節(jié)功能，主要由T 細胞與NK 細胞分泌的可溶性蛋白糖構(gòu)成，可提高機體的抗感染能力[17]。飼料中添加0.8%精氨酸可顯著上調(diào)冷應(yīng)激仔豬IFN-γ基因的表達量[17]。本試驗精氨酸的添加量約為0.1%，但試驗結(jié)果卻與之相一致。MX1 與IFIT 家族分子是在正常情況下表達量低，但機體炎癥反應(yīng)的條件下受到LSP、外源雙鏈RNA、病毒等刺激時會強烈表達[18-19]。方義軍等[20]研究表明，IFIT1 是通過DNA 信號通路負反饋上調(diào)了IFN-β的表達，從而對病毒入侵發(fā)揮了保護作用。本試驗日糧中添加1.00%復合氨基酸提高了回腸黏膜IFN-β、IFN-γ基因的相對表達量，降低了MX1、IFIT1基因的相對表達量，說明添加此種復合氨基酸提高了斷奶仔豬免疫能力，降低了斷奶應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)。

3.4 復合氨基酸對斷奶仔豬空腸黏膜能量的影響 ATP是機體內(nèi)直接用于做功的能量物質(zhì)，在生物體內(nèi)能量交換中起著至關(guān)重要的作用，正常狀態(tài)下體內(nèi)約80% 的ATP 在線粒體中產(chǎn)生，然后供應(yīng)到全身各處，為細胞各種生理功能提供必需的能量。TAN 的大小可以反映線粒體生成高能磷酸化合物的能力，同時也顯示了細胞的儲存能量的狀態(tài)[21]。谷氨酸可以與草酰乙酸通過轉(zhuǎn)氨基產(chǎn)生α-酮戊二酸和天冬氨酸，α-酮戊二酸進入線粒體參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP。秦琴等[22]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加2.00%谷氨酸可以參與調(diào)節(jié)小腸的能量代謝相關(guān)通路，為腸道完整性和維持功能提供能量。谷氨酰胺是免疫細胞重要的能源物質(zhì)，日糧中添加1.00%谷氨酰胺能夠促進巨噬細胞和淋巴細胞的增殖和分化，利用碳鏈并氧化成ATP 為小腸細胞供能[23]。日糧中添加1.20‰ N-乙酰半胱氨酸能夠參與機體的糖代謝與三羧酸循環(huán)，促進宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬小腸ATP 的生成，為小腸補充能量[24]。AMP 亦存在一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)稱為環(huán)-單磷酸腺苷（cAMP），ATP 在某些細胞中可以在腺苷環(huán)化酶的催化下成為cAMP。cAMP 是介導激素作用的“第二信使”，參與了動物體內(nèi)各種酶活以及生長因子的代謝過程[23]。本試驗所用方法檢測的AMP 中可能存在有cAMP，故AMP 的升高。本試驗日糧中添加1.00%復合氨基酸，在各種氨基酸成分比例較低的基礎(chǔ)上，仍提高了斷奶仔豬空腸的ATP、AMP 與TAN，說明日糧中添加1.00%復合氨基酸能夠增加腸道的能量儲備。

3.5 復合氨基酸對斷奶仔豬空腸游離氨基酸的影響 氨基酸作為機體免疫系統(tǒng)的基本單元，對維持機體免疫功能、抵抗與消除疾病有重要作用[5]。伍國耀[25]研究表明，精氨酸內(nèi)源合成主要通過小腸-腎代謝軸完成，幼年動物精氨酸主要在小腸中合成。對仔豬來說，精氨酸是一種必需氨基酸，對生長免疫有重要作用，可以在小腸內(nèi)被分解利用，進入細胞后在酶的作用下降解，產(chǎn)生一氧化氮、鳥氨酸、多胺、脯氨酸等[26]。精氨酸通過Arg-NO-HSP70 途徑維護腸道健康，促進小腸黏膜生長[27]，在日糧中添加0.5%～1.0% 精氨酸可以防止腸道功能障礙，促進腸黏膜生長[28]。瓜氨酸在精氨酸琥珀酸合成酶與精氨酸琥珀酸裂解酶作用下轉(zhuǎn)化成精氨酸，在這個過程中每合成一分子精氨酸需要2 個ATP[26]。張莉莉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，口服精氨酸可顯著提高小腸精氨酸代謝相關(guān)氨基酸的水平，緩解宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬的腸道內(nèi)源精氨酸合成不足，發(fā)揮腸道營養(yǎng)作用。本研究結(jié)果顯示，日糧中添加1.00%復合氨基酸提高了空腸精氨酸和瓜氨酸的含量，這可能與其提高空腸ATP 水平有關(guān)，能量儲備的增加有利于內(nèi)源精氨酸的合成。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，日糧中添加1.00% 復合氨基酸可以有效降低斷奶仔豬的腹瀉率，這可能與其提高仔豬免疫力，增加腸道能量儲備和精氨酸水平有關(guān)。