柏 瑪，胡明軍，楊遠(yuǎn)瀟，趙文仕，江明鋒

（1.云南香格里拉市畜牧獸醫(yī)局飼料草山站，云南香格里拉 674499；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都 610041；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

低氧適應(yīng)性是指機(jī)體在低氧環(huán)境、高原低氧以及疾病導(dǎo)致機(jī)體氧獲得和運(yùn)送出現(xiàn)障礙時(shí)，為維持基本生命活動(dòng)所建立的一套保護(hù)性機(jī)制。機(jī)體對(duì)低氧的適應(yīng)除器官功能的變化外，還可能通過調(diào)整低氧誘導(dǎo)因子和細(xì)胞代謝來完成[1]。調(diào)控低氧信號(hào)傳導(dǎo)的主要轉(zhuǎn)錄因子是低氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia-inducible Factors-1，HIF-1），該因子先由Semenza 等[2]于1992 年在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)。HIF-1 是一個(gè)小轉(zhuǎn)錄因子家族，高度保守，主要介導(dǎo)細(xì)胞在低氧環(huán)境下的應(yīng)答，可以促進(jìn)血管分化，對(duì)胚胎和腫瘤中血管的形成十分重要[2]。HIF-1 轉(zhuǎn)錄因子主要有HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α、HIF-3β共6 個(gè)成員。其中，HIF-1α和HIF-3α被認(rèn)為與低氧誘導(dǎo)反應(yīng)直接相關(guān)。在氧氣含量正常的組織中HIF-1α的表達(dá)水平較低，但在組織缺氧時(shí)，HIF-1α表達(dá)水平顯著上調(diào)且其表達(dá)水平受其富含GC 序列元件的啟動(dòng)子調(diào)控[3]；HIF1AN 是HIF-1α的抑制蛋白，可降低HIF-1α的表達(dá)水平。HIF-3α也被認(rèn)為與低氧適應(yīng)反應(yīng)有關(guān)，是低氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的負(fù)抑制因子[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1 起著核信號(hào)的作用[5]，共有100多種低氧相關(guān)基因受到HIF-1 的調(diào)節(jié)。如促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）作為HIF-1的一個(gè)下游基因，其表達(dá)受到HIF-1 的調(diào)控。在缺氧缺血的體外模型中，EPO 以劑量依賴的方式抑制HIF-1基因的表達(dá)[6]。缺氧作為一種普遍刺激，影響著許多生理過程，如許多生活在海平面上的人患有慢性間歇性缺氧（IH），這是一種由睡眠呼吸暫停導(dǎo)致的心血管和呼吸系統(tǒng)疾病。研究表明，DNA 甲基化改變是由慢性IH 引起的病理變化，并可能影響缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)[7]。Dewi 等[8]研究還發(fā)現(xiàn)，在正常（非低氧）情況下，EPO啟動(dòng)子增強(qiáng)子區(qū)的甲基化降低了EPO基因的轉(zhuǎn)錄活性。Xiong[9]等研究表明，牦牛心、肝、脾、腎和肺等組織中的HIF-1α和HIF-2α基因表達(dá)量均顯著高于普通牛，牦牛這些組織中HIF-1α和HIF-2α基因增強(qiáng)子區(qū)的甲基化水平顯著低于普通牛。青藏高原是天然的低氧環(huán)境，世居的哺乳動(dòng)物經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化形成特有的耐低氧機(jī)制[10]。但導(dǎo)致這一系列現(xiàn)象的分子機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)行深入研究。本項(xiàng)目研究了牦牛心、肝、肺、腦、肌肉等組織中EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN4 個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度對(duì)其表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探明牦牛低氧適應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 在四川省紅原縣龍日種畜場(chǎng)采集3 頭健康成年公牦牛的心、肺、腦、肝臟和肌肉組織，迅速放入液氮中保存。

1.2 牦牛不同組織總DNA 的提取 采用AxyPrep 基因組DNA 小量試劑盒（AXYGEN，Union city，USA），按說明書步驟提取牦牛各組織樣品總DNA，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

1.3 亞硫酸鹽測(cè)序 采用甲基化試劑盒EZ DNA Methyl ation-KitTM（ZYMO RESEARCH，Los Angeles，USA）對(duì)DNA 進(jìn)行處理，詳細(xì)步驟參見試劑盒說明書，處理后的DNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因啟動(dòng)子克隆 根據(jù)普通牛EPO基因（NM_173909）、HIF-1α基因（NM_174339）、HIF-3α基因（NM_001105342）以及HIF-1AN基因（NM_001083443）的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增相應(yīng)基因啟動(dòng)子的引物（表1）。以亞硫酸鹽修飾后的DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，25 μL PCR 體系：模板2 μL（80 ng）、10×buffer 2.5 μL、EX-Taq（TaKaRa）0.2 μL（1 U），上下游引物各1 μL（10 pmol/L）。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸2 min 進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸7 min、4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收相應(yīng)目的DNA 片段。

1.5 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因啟動(dòng)子甲基化分析 利用www.urogene.org/methprimer 網(wǎng)站在線生物信息學(xué)軟件分析克隆的4 個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，對(duì)其核心啟動(dòng)子序列及位置進(jìn)行分析。用不同組織提取的基因組DNA 作模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)?；厥障鄳?yīng)目的DNA片段，并連接到PMD19-T 載體上。挑取重組子測(cè)序，然后進(jìn)行序列分析，檢測(cè)各個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)段的甲基化數(shù)目。

1.6 總RNA 的提取與cDNA 合成 將采集的牦牛心、肺、腦、肝臟和肌肉組織各0.6 g 放入預(yù)先用液氮冷卻的研缽內(nèi)，研磨成粉，然后加入Trizol Reagent（Invitrogen，Cakifornia,USA）提取總RNA。采用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser DRR047A（TaKaRa，中國(guó)大連）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以O(shè)ligo dT 為引物合成第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)?7℃ 15 min，85℃5 s，然后4℃保存，得到的cDNA 作為qPCR 實(shí)驗(yàn)的模板，置于-80℃冰箱備用。

1.7 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因的組織表達(dá)研究 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中普通牛EPO、HIF-1α、HIF-3α、HIF-1AN、β-actin、GAPDH基因序列（登錄號(hào)見1.4）設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物用于相應(yīng)基因的組織表達(dá)研究（表2）。用BIO-RAD CFX96 熒光定量PCR 儀篩選出RT-qPCR 的最適溫度后，以牦牛的心臟、肝臟、肺、腦、肌肉組織cDNA 為模板，采用10 μL反應(yīng)體系：SsoFastTM EvaGreen?Supermix 5 μL、上下游引物各0.5 μL（10 pmol/L）、cDNA 1 μL（0.5 μg）、ddH2O 3 μL 進(jìn)行qRT-qPCR，每個(gè)樣本均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，檢測(cè)各基因的表達(dá)量。反應(yīng)程序：95℃ 10 min、95℃15 s、最適溫度1 min，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s、65℃ 5 s。以β-actin 基因和GAPDH基因作為內(nèi)參基因，取平均值，用2-△△Ct法計(jì)算各基因表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行分析。不同組織間mRNA 相對(duì)表達(dá)量差異采用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，甲基化率差異采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN4 個(gè)基因啟動(dòng)子克隆 圖1 及測(cè)序結(jié)果表明，EPO基因啟動(dòng)子長(zhǎng)870 bp，HIF-3α基因啟動(dòng)子長(zhǎng)1 067 bp，HIF-1α基因啟動(dòng)子長(zhǎng)1 067 bp，HIF-1AN基因啟動(dòng)子長(zhǎng)1 669 bp。EPO、HIF-1α、HIF-3α及HIF-1AN核心啟動(dòng)子序列分析結(jié)果顯示，EPO基因啟動(dòng)子中含有1 個(gè)核心區(qū)段，HIF-1α、HIF-3α、HIF-1AN基因啟動(dòng)子各含有2 個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)段。

表1 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因啟動(dòng)子克隆引物

表2 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因qRT-PCR 引物

圖1 牦牛低氧適應(yīng)相關(guān)基因啟動(dòng)子PCR 產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

2.2 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因核心啟動(dòng)子甲基化檢測(cè) 牦牛EPO基因核心啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)127 bp，包含8 個(gè)CpG 島，在腦組織中的甲基化水平顯著高于心臟和肌肉組織（圖2）。由表3 可知，EPO基因在心臟、肌肉和腦組織中，CpG 島發(fā)生甲基化的位點(diǎn)分別有4、10 個(gè)和18 個(gè)，EPO基因在牦牛心、肌肉、腦的甲基化率分別為8.3%、20.8%、45.0%，牦牛腦中的甲基化率顯著高于心臟和肌肉組織。

牦牛HIF-1α基因核心啟動(dòng)子有2 段序列，長(zhǎng)度分別為221 bp 和117 bp，包含24 個(gè)CpG 島。HIF-1α基因在肝、心臟和肌肉組織中甲基化的CpG 島數(shù)目為：3個(gè)、12 個(gè)和17 個(gè)（表3）。HIF-1α基因的核心啟動(dòng)子在肝臟、心臟和肌肉的甲基化率分別為2.5%、8.5%、12.1%，且在牦牛肌肉中的甲基化率極顯著高于心臟和肝臟。

圖2 EPO 基因核心啟動(dòng)子在組織中的甲基化位點(diǎn)圖

牦牛HIF-3α基因核心啟動(dòng)子有2 段序列，長(zhǎng)度分別為252 bp 和163 bp，包含22 個(gè)CpG 島。HIF-3α基因在心臟、腦和肝組織中甲基化的CpG 島數(shù)目為：6 個(gè)、10 個(gè)和14 個(gè)（表3），其核心啟動(dòng)子在心臟、腦和肝臟中的甲基化率分別為5.5%、9.1%、12.7%，且在牦牛肝臟中的甲基化率極顯著高于心臟和腦。

牦牛HIF-1AN基因核心啟動(dòng)子有2 段序列，長(zhǎng)度分別為271 bp 和167 bp，包含20 個(gè)CpG 島。HIF-1AN基因在心臟、腦和肺組織中甲基化的CpG 島數(shù)目為：21、68 個(gè)和87 個(gè)（表3）。HIF-1AN基因的核心啟動(dòng)子在心、腦和肺中的甲基化率分別為22.8%、69.4%、87.0%，并且在牦牛肺中的甲基化率極顯著高于心臟和腦。

2.3 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因的組織差異表達(dá)分析 由圖3 可知，EPO基因的表達(dá)水平除在肺和肌肉之間差異不顯著外，在其余組織間差異極顯著；牦牛HIF-1α基因在肝組織和腦組織間差異顯著，其余組織間差異極顯著；HIF-3α基因在肺和肌肉組織間差異顯著，其余組織間差異極顯著；HIF-1AN基因在肝臟和肌肉組織差異不顯著，肝臟和肌肉組織與腦組織間差異顯著，其余組織間差異極顯著。

表3 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因核心啟動(dòng)子的甲基化率分析

圖3 EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因在牦牛不同組織的表達(dá)量

3 討 論

對(duì)低海拔地區(qū)的動(dòng)物而言，長(zhǎng)期暴露在較嚴(yán)重的缺氧環(huán)境中對(duì)機(jī)體是有害的。高原世居動(dòng)物則不受低氧環(huán)境的損害，表明高原世居動(dòng)物已經(jīng)完全適應(yīng)高原低氧的生態(tài)環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，EPO基因在牦牛心臟的表達(dá)量最高，其次是肺、肌肉和肝臟，在腦組織中表達(dá)量最低。缺氧是EPO基因轉(zhuǎn)錄水平增加的主要原因。對(duì)EPO基因的表達(dá)和調(diào)控起最主要作用的是[A/G]CGTG 序列，其編碼基因vegf和EPO啟動(dòng)子區(qū)域已被證實(shí)均含有低氧效應(yīng)原件（HRE），表明EPO基因是受HIF-1 調(diào)控的靶基因[10-11]；HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因在牦牛不同組織表達(dá)差異顯著。在缺氧環(huán)境中，HIF-1α亞基的降解途徑被抑制，大量的HIF-1α蛋白積累并結(jié)合HIF-1β形成具有活性的HIF-1 因子。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種HIF-α/β亞基的類型。HIF-1α/β被認(rèn)為是介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的主要調(diào)控因子。HIF-1 廣泛存在于大多數(shù)組織中，而HIF-2 主要在高度血管化的器官和組織中表達(dá)[12]。Naik 等[13]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1AN作為HIF-1α抑制因子，能夠抑制HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)形成體外小管和遷移細(xì)胞。Li 等[14]在人的Ⅱ型肺細(xì)胞研究過程中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與HIF-3α基因在表達(dá)模式和應(yīng)答方式上具有一致性，這說明二者在功能上可能起著互補(bǔ)的作用，共同確保細(xì)胞在低氧的環(huán)境中正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

造成這3 個(gè)基因在不同組織表達(dá)出現(xiàn)差異的原因可能是相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度不一。由于啟動(dòng)子區(qū)域的高度甲基化，使它們?cè)谟行┙M織中沉默。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和HIF-1AN基因在不同組織間的表達(dá)量存在差異。HIF-1能夠誘導(dǎo)靶基因在紅細(xì)胞和組織中表達(dá)，同時(shí)抑制如EPO等有關(guān)基因的表達(dá)。EPO作為HIF-1的靶基因，當(dāng)?shù)脱鯐r(shí)HIF-1α表達(dá)水平增加，HIF-1α從胞漿移入胞核，與胞核內(nèi)HIF-1β結(jié)合產(chǎn)生HIF-1，并與靶基因HRE 中HIF-1 結(jié)合點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)EPO轉(zhuǎn)錄，引起一系列細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)[15]。長(zhǎng)時(shí)間處于低氧環(huán)境下，上調(diào)HIF-1 活性可以使細(xì)胞在低氧狀況下的生存能力提高，并生成大量組織血管[16]。組織中氧供給和利用在達(dá)到平衡之前，HIF-1基因的mRNA一直被表達(dá)，直到新的平衡建立。在新平衡建立后，若給予更進(jìn)一步的低氧刺激，HIF-1基因的mRNA 水平又明顯增加[17]，這說明HIF-1基因的mRNA 與缺氧程度存在明顯的依存關(guān)系。

為了研究牦牛組織中EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因差異表達(dá)的遺傳學(xué)機(jī)制，本文擴(kuò)增了牦牛4 個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)序列并進(jìn)行了甲基化檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN等低氧相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域在不同組織中的甲基化率存在顯著差異。牦牛HIF-1AN基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化率顯著高于其他3 個(gè)基因。結(jié)合4 個(gè)基因在相關(guān)組織的表達(dá)量來看，表達(dá)量高的組織如心臟，甲基化率低。與此相反，表達(dá)量低的組織相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化率高，這說明基因啟動(dòng)子甲基化影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而抑制其表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)HIF-1AN基因在組織中的表達(dá)顯著高于其他3 個(gè)基因，進(jìn)一步說明甲基化可能是導(dǎo)致牦牛組織中低氧適應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)制之一。這與Xiong 等[9]和Reik[18]發(fā)現(xiàn)的基因甲基化水平與表達(dá)量的關(guān)系一致。在人類癌癥中，腫瘤與正常的細(xì)胞相比，甲基化水平發(fā)生很大的變化，在腫瘤的發(fā)生過程中基因組DNA 呈現(xiàn)整體低甲基化和局部高甲基化特點(diǎn)[19]。這可能是HIF-1甲基化導(dǎo)致原癌基因的過度表達(dá)和正?；虺聊a(chǎn)生的后果。隨著缺氧組織適應(yīng)性研究的進(jìn)展，低氧核心調(diào)節(jié)因子HIF-1所誘導(dǎo)的一系列低氧反應(yīng)效應(yīng)基因及其有關(guān)甲基化的研究，將為缺氧組織的適應(yīng)性及人類疾病帶來福音。

4 結(jié) 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因在心、肝、肺、腦、肌肉等5 個(gè)組織的表達(dá)量與其啟動(dòng)子的甲基化率存在負(fù)相關(guān)，基因表達(dá)量受甲基化水平的影響，本研究結(jié)論為牦牛低氧適應(yīng)領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。