張 艷 ，敖 葉，周志楠，韋仕南，陳 祥*，洪 磊，宋俊偉

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊是貴州省地方肉用山羊品種之一，有著獨(dú)特的生境特征、體貌特征及生產(chǎn)、繁殖性能特征。黔北麻羊產(chǎn)肉性能好，繁殖率高，抗病力強(qiáng)，適應(yīng)山區(qū)粗放飼養(yǎng)，具有較大的發(fā)展?jié)摿Γ?011 年被列入《中國畜禽遺傳資源志·羊志》，成為國家級新遺傳資源[1]。

抑制素（Inhibin，INH）是由羊卵巢顆粒細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGFβ）超家族成員，在哺乳動物體內(nèi)分布廣泛。該家族主要調(diào)控細(xì)胞的生長與分化，由α亞基和β亞基（βA、βB）構(gòu)成。抑制素α亞基（INHA）由α亞基二硫鍵連接而成，抑制素βA亞基（INHBA）基因則由α亞基和βA亞基所組成[2-3]。抑制素可協(xié)同激活素通過內(nèi)分泌、旁分泌以及自分泌等途徑特異性抑制垂體前葉合成并分泌促卵泡素（FSH）與促黃體素（LH）進(jìn)而影響雌性動物卵泡的發(fā)育和排卵的數(shù)量，但抑制素分泌過多則會抑制FSH 與LH 的分泌[4]。有研究表明，INHA基因主要在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，可能會通過調(diào)節(jié)其mRNA 表達(dá)量的變化影響從江香豬卵巢的生長和卵泡的發(fā)育[5]。此外，在小尾寒羊上的研究發(fā)現(xiàn)INHA基因AB 型的平均產(chǎn)羔數(shù)比AA型多0.57 只，在卵泡生長發(fā)育的各個階段均能檢測到INHA基因的表達(dá)[6]。山羊INHBA基因位于3 號染色體的第4 個外顯子區(qū)域內(nèi)，有研究表明INHBA基因可能是控制山羊高繁殖力性狀的主效基因，或與之存在一定程度的連鎖[7]。Hiendleder[8]發(fā)現(xiàn)INHBA基因?qū)d羊產(chǎn)羔數(shù)有著顯著效應(yīng)，INHBA基因也可以影響巴美肉羊的產(chǎn)羔數(shù)[9]。另外INHBA基因在牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡以及排卵過程中發(fā)揮重要作用[10]。目前，有研究顯示INHA、INHBA基因不僅在動物進(jìn)化中比較保守，同時也已被確定為細(xì)毛羊多胎性狀的候選基因[11]，但兩者在黔北麻羊中的研究鮮見報道。本實驗以單、多羔黔北麻羊為研究對象，采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測目的基因INHA、INHBA在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達(dá)量，為進(jìn)一步探究INHA、INHBA基因與黔北麻羊產(chǎn)羔性狀的遺傳機(jī)制及基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 黔北麻羊來自貴州省習(xí)水縣富興畜牧業(yè)有限公司，本實驗選取經(jīng)產(chǎn)單、多羔黔北麻羊母羊各6只進(jìn)行屠宰，采集子宮、輸卵管、垂體、下丘腦和卵巢等5 個組織，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 紫外可見分光光度計，購自美國Thermo Fisher 有限公司；電泳儀（DYY-2C 型），購自北京市六一儀器廠；PCR 擴(kuò)增儀（C1000 TouchTM）、實時熒光定量PCR 儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ），均購自美國BIO-RAD 有限公司。

1.3 主要試劑 RNA 提取試劑TRIzol、液氮（-196℃）、三氯甲烷、0.5×TAE 緩沖液、異丙醇、75% 乙醇、西班牙瓊脂糖購自貴州羅德宏信生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑2×Ts Master qRT-PCR Mix 購自擎科生物科技有限公司；cDNA 第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織中提取RNA 及cDNA 的合成 按照TRIzol法提取單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢組織中的總RNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒對提取的組織總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。將單、多羔母羊不同組織RNA 濃度分別定量至100 ng/μL，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：RNA 模板1 ng/μL，dNTP Mix 2.5 mM Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L）2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free Water 6 μL。將以上體系加入無酶0.2 mL的PCR 小管，振蕩混勻，短暫離心后，于PCR 儀上42℃孵育50 min，85℃孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取1 μL 反應(yīng)產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進(jìn)行濃度和純度檢測，-20℃保存，備用。

1.4.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 上傳的山羊INHA基因與INHBA基因序列，設(shè)計INHA基因、INHBA基因熒光定量引物（Primer Premier 5.0 軟件），以β-actin為熒光定量內(nèi)參基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

1.4.3 實時熒光定量PCR 條件優(yōu)化及反應(yīng) 運(yùn)用qRTPCR 對INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢等組織的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，對退火溫度及引物進(jìn)行摸索并優(yōu)化反應(yīng)條件，確定最佳反應(yīng)體系及退火溫度。β-actin為內(nèi)參基因，在每次實驗時設(shè)計3 個相同水平的重復(fù)，最終確定實時熒光定量PCR 實驗最佳條件，并將單、多羔黔北麻羊母羊的不同組織cDNA 等濃度稀釋（500 ng/μL），qRT-PCR 反應(yīng)體系為10 μL：qPCR Mix 5 μL、上下游引物（10 pmol/L）各0.3 μL、cDNA 1 ng/μL、ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性135 s；95℃變性15 s；退火30 s（INHA、INHBA基因最佳退火溫度為56.7℃）；68℃延伸30 s；由機(jī)器自動設(shè)置（基礎(chǔ)溫度60℃ 每5 s 增加0.5℃擴(kuò)增至95℃）進(jìn)行熔解曲線分析。

1.4.4 統(tǒng)計分析 采用2-△△Ct法分析INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢中的差異表達(dá)量，用T 檢驗對INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達(dá)差異性并用單因素方差分析與最小顯著性差異檢驗表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1INHA、INHBA基因在各組織中PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 以合成的cDNA 第一鏈為模板對INHA、INHBA基因進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果可見目的產(chǎn)物條帶透明、引物二聚體極弱，特異性強(qiáng)，與目的片段大小一致（圖1），可用于進(jìn)行下一步實驗。

2.2 qRT-PCR 的擴(kuò)增曲線和熔解曲線 由圖2、圖3 可知，經(jīng)過熒光定量PCR 反應(yīng)后得到的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，在黔北麻羊各組織中INHA、INHBA基因擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)完好的“S”形狀，曲線平滑未出現(xiàn)特殊趨勢。循環(huán)閾值（CT）都處于擴(kuò)增曲線的對數(shù)期，熔解曲線均呈單峰，峰值較好，無引物二聚體，特異性強(qiáng)，無雜峰。

表1 引物序列信息

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2 INHA 基因擴(kuò)增曲線與熔解曲線

圖3 INHBA 基因擴(kuò)增曲線與熔解曲線

2.3INHA、INHBA基因在黔北麻羊不同組織中的表達(dá)分析 由圖4 可知，INHA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢5 個組織中均有表達(dá)，在卵巢組織中表達(dá)量最高且表達(dá)高于其他組織（P＜0.01）。INHA基因在單羔黔北麻羊各組織中表達(dá)量依次為：卵巢＞輸卵管＞垂體＞下丘腦＞子宮，卵巢表達(dá)極顯著高于子宮、輸卵管、垂體和下丘腦4 個組織，輸卵管表達(dá)也高于子宮、垂體和下丘腦（P＜0.01），其余組織間的表達(dá)均未達(dá)到差異顯著水平；INHA基因在多羔黔北麻羊中表達(dá)量依次為：卵巢＞垂體＞下丘腦＞輸卵管＞子宮，垂體組織表達(dá)高于子宮和輸卵管（P＜0.01）。單、多羔組間對比分析可知單羔卵巢組織表達(dá)高于多羔卵巢組織（P＜0.01），單羔輸卵管表達(dá)高于多羔組（P＜0.01）；其中多羔組的垂體表達(dá)高于單羔組（P＜0.01），而多羔組下丘腦表達(dá)高于單羔組（P＜0.05），在子宮中表達(dá)差異未達(dá)到顯著水平。

由圖5 可知，INHBA基因在單、多羔黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢等5 個組織中均有表達(dá)，均在卵巢組織中的表達(dá)量最高且高于其他組織（P＜0.01）。INHBA基因在單羔黔北麻羊各組織中表達(dá)量依次為：卵巢＞輸卵管＞子宮＞垂體＞下丘腦，卵巢表達(dá)高于其余4 個組織（P＜0.01），子宮、輸卵管和卵巢組織表達(dá)均高于下丘腦組織（P＜0.01），而子宮表達(dá)高于垂體組織（P＜0.05），其余組織間均未達(dá)到差異顯著水平。INHBA基因在多羔黔北麻羊各組織中表達(dá)量依次為：卵巢＞子宮＞輸卵管＞垂體＞下丘腦，子宮表達(dá)量高于輸卵管、垂體和下丘腦組織（P＜0.01）；輸卵管和垂體表達(dá)均高于下丘腦（P＜0.05），其余組織間未達(dá)到差異顯著水平。單、多羔組間進(jìn)行對比分析可知，多羔組卵巢和子宮的表達(dá)量均高于對應(yīng)單羔組（P＜0.01）；且多羔組下丘腦表達(dá)高于單羔組（P＜0.01）；其余組織間未達(dá)到顯著水平。

圖4 INHA 基因在單、多羔黔北麻羊不同組織表達(dá)差異

圖5 INHBA 基因在單、多羔黔北麻羊不同組織表達(dá)差異

3 討 論

3.1INHA基因在黔北麻羊單、多羔性腺軸組織中的變化規(guī)律 本研究通過qRT-PCR 技術(shù)對INHA基因在單、多羔黔北麻羊各組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，均檢測到了不同程度的表達(dá)，而鄭杰等[12]研究也發(fā)現(xiàn)INHA基因在2 個不同山羊品種的卵巢、垂體均有表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在單、多羔組內(nèi)均是卵巢組織表達(dá)極顯著高于其他組織，但2 個品種間無顯著性差異的結(jié)果與本實驗結(jié)果相反，可能基于不同品種及地理氣候環(huán)境間的差異導(dǎo)致。靳興濤等[13]研究發(fā)現(xiàn)INHA基因在多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢組織皆有表達(dá)，推測該基因可能定位于山羊的卵巢組織，而本實驗發(fā)現(xiàn)INHA在單、多羔組黔北麻羊卵巢組織中表達(dá)量均最高，推測INHA基因可能與山羊的產(chǎn)羔率存在一定的相關(guān)性，但對其是否在黔北麻羊的卵泡發(fā)育過程中存在類似的功能還需進(jìn)一步研究。Cui 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR 技術(shù)顯示INHA主要在雞第300 天的卵泡中表達(dá)，在排卵前第五大卵泡（F5）中發(fā)現(xiàn)最高的INHAmRNA 豐度，說明該基因的表達(dá)不是持續(xù)性表達(dá)，在排卵前的極高表達(dá)推測其可能有助于排卵，但本研究還未深入到卵泡發(fā)育及排卵階段，對于山羊是否也存在類似的現(xiàn)象有待深究；易凡利等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)情期相比，INHA基因在發(fā)情期香豬卵巢中的表達(dá)水平極顯著升高，并且對卵巢組織有一定的調(diào)節(jié)作用；對于黔北麻羊而言，在不同卵泡發(fā)育階段INHA基因的表達(dá)是否存在差異性表達(dá)，甚至是不表達(dá)，尚不能定論。本研究結(jié)果顯示INHA基因在多羔組的卵巢組織表達(dá)極顯著高于單羔組卵巢組織，與趙中權(quán)[16]研究發(fā)現(xiàn)INHA基因在山羊性腺軸卵巢組織中表達(dá)水平均最高的實驗結(jié)果相同，說明INHA基因主要存在卵巢中，但對其在卵巢組織中具體發(fā)揮某種功能，以及是否有助于提高排卵率還需更深入的探究。

3.2INHBA基因在黔北麻羊單、多羔性腺軸組織中的變化規(guī)律 Chen 等[17]研究發(fā)現(xiàn)INHBA主要作用于母羊的卵巢組織，可能是影響母羊卵泡生長、排卵的相關(guān)基因；Yang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)INHBA基因與綿羊繁殖性狀相關(guān)，能直接或間接的調(diào)控mRNA 的表達(dá)；而在本實驗中發(fā)現(xiàn)INHBA基因均在黔北麻羊單、多羔組的卵巢組織表達(dá)量最高，且大量在多羔卵巢組織中表達(dá)，推測其主要作用于卵巢組織，可能與黔北麻羊的高繁殖性能存在一定的關(guān)聯(lián)性。索峰[19]通過qRT-PCR 方法檢測出INHBA和INHA基因在巴美肉羊發(fā)情后1 h、12 h 和24 h 時間點(diǎn)子宮和卵巢組織中存在差異表達(dá)，表達(dá)量先升高后降低；在排卵期抑制素表達(dá)量變化較大，經(jīng)產(chǎn)雙羔巴美肉羊發(fā)情后比經(jīng)產(chǎn)單羔巴美肉羊提前排卵，且排卵數(shù)量多于經(jīng)產(chǎn)單羔母羊；INHBA基因在子宮中的表達(dá)量變化隨卵巢變化而變化，說明INHBA基因在一定程度上也作用于子宮，但作者對于在子宮的具體功能未做深入研究；INHBA基因在經(jīng)產(chǎn)多羔山羊子宮和卵巢組織中的大量表達(dá)，提示該基因可能有助于提高有效排卵率，從而間接影響著山羊的繁殖性能。Onagbesan[20]等通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在雞的整個性成熟前直至18周齡，所有抑制素亞型的mRNA 均能夠在雞的睪丸中表達(dá)，但在卵巢中INHBA基因的表達(dá)量較低；這與本實驗得出的結(jié)果相反，推測是不同物種所致，INHBA基因在單胃動物雞與反芻動物黔北麻羊的卵巢中表達(dá)量存在較大差異，但具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。相反的是Safi[21]等通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)雞INHBA、INHA基因均在雞卵巢組織中有表達(dá)；且在所有年齡段，卵巢中INHBA基因的表達(dá)均顯著高于INHA基因。孫君衛(wèi)[22]等研究發(fā)現(xiàn)INHBA基因隨著卵泡的發(fā)育表達(dá)量逐漸升高，且在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量最高，這提示INHBA基因定位卵巢，并對卵泡發(fā)育有著重要影響。這些結(jié)果均顯示INHBA基因在卵巢有表達(dá)，并一定程度上調(diào)控卵泡的生長發(fā)育；INHBA基因在黔北麻羊卵巢和子宮組織中表達(dá)，并且表達(dá)量均極顯著高于單羔組，推測INHBA基因可能參與黔北麻羊卵巢組織的生殖調(diào)控且對多羔性狀有一定程度的影響。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，INHA、INHBA基因在單、多羔黔北麻羊各組織中均有表達(dá)，且均在卵巢組織中的表達(dá)最高，INHA基因在子宮中的表達(dá)最低；INHBA在下丘腦中的表達(dá)最低，說明INHA、INHBA基因可能作用于卵巢中，并在卵巢中發(fā)揮一定的作用，結(jié)果提示可為后續(xù)研究山羊高繁殖性能提供實驗依據(jù)。