仲富瑞, 程宦立, 張 浩, 杜毅超,b, 胡啟輝, 付文廣,b, 夏先明,b

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a. 肝膽外科； b. 四川省院士(專家)工作站， 四川 瀘州 64600

Effectofkaempferolontheproliferation,migration,invasion,andapoptosisofhumanhepatomaBel-7402cells

ZHONGFuruia,CHENGHuanlia,ZHANGHaoa,DUYichaoa,b,HUQihuia,FUWenguanga,b,XIAXianminga,b.

(a.DepartmentofHepatobiliarySurgery,b.Academician(Expert)WorkstationofSichuanProvince,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan64600,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of kaempferol on the proliferation, migration, invasion, and apoptosis of human hepatoma Bel-7402 cells and related molecular mechanism.MethodsHepatoma Bel-7402 cells cultured in vitro were randomly divided into control group and low-, middle-, and high-concentration experimental groups. The experimental groups were treated with low-, middle-, and high-concentration kaempferol (25, 50, and 100 μmol/L), and the control group was treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide. CCK-8 assay was used to observe the effect of kaempferol on the viability of Bel-7402 cells; plate colony formation assay was used to evaluate the effect of kaempferol on cell colony formation ability; wound healing assay and Transwell chamber were used to observe the effect of kaempferol on cell migration and invasion; Western blot was used to measure the expression of apoptosis- and cycle-related proteins. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between two groups.ResultsAfter 24 hours of treatment, the cell viability was 100.00%±2.72% in the control group and 75.70%±2.42%, 62.79%±2.45%, and 43.41%±2.11%, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and compared with the control group, the experimental groups had a significant reduction in cell viability (allP<0.05). The number of cell colonies was 923.3±35.2 in the control group and 682.7±24.4, 464.0±22.0, and 327.3±14.0, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and compared with the control group, the experimental groups had a significant reduction in cell colony formation ability (allP<0.05). After 24 hours of treatment, the relative migration rate was 100.00%±1.11% in the control group and 63.33%±1.16%, 51.72%±3.23%, and 37.18%±2.71%, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups, and the number of transmembrane cells was 212.0±3.0 in the control group and 134.0±2.0, 71.0±2.0, and 34.0±1.0, respectively, in the low-, middle-, and high-concentration experimental groups; compared with the control group, the experimental groups had significant reductions in relative migration rate and number of transmembrane cells (allP<0.05). After 48 hours of treatment, compared with the control group, the low-, middle-, and high-concentration experimental groups had a significant reduction in the expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 (allP<0.05), a significant increase in the expression of the pro-apoptotic protein Bax (allP<0.05), and a significant reduction in the expression of CyclinD1 (allP<0.05).ConclusionKaempferol can inhibit the proliferation, migration, and invasion of human hepatoma Bel-7402 cells and promote the apoptosis of such cells, possibly by regulating the apoptosis proteins Bax and Bcl-2 and downregulating the expression of CyclinD1.

Keywords：kaempferol; liver neoplasms; cell proliferation; cell movement; apoptosis

原發(fā)性肝癌是人類消化系統(tǒng)最常見的癌癥之一[1]，在我國(guó)尤為高發(fā),具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)[2]。隨著手術(shù)切除、射頻消融、靶向治療等治療手段不斷發(fā)展，肝癌患者的預(yù)后得到了一定改善，但治療后的復(fù)發(fā)率仍較高，整體的5年生存率仍不理想[3]，因此尋找有效地抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的天然藥物，無疑具有重大意義。山萘酚(Kaempferol, KA)是一種從傳統(tǒng)中藥趕黃草中提取的天然黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理研究[4]發(fā)現(xiàn)KA具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理活性，且有研究證明KA能夠通過不同的機(jī)制抑制卵巢癌[5]、結(jié)直腸癌[6]等癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。但KA在肝癌中的基礎(chǔ)研究較少，故本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，探討KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞體外克隆形成、增殖、侵襲遷移、凋亡的影響，也將闡述可能的分子機(jī)制，以期為KA用于新藥開發(fā)及肝癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌Bel-7402細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美上海中喬新舟生物科技有限公司，山萘酚、結(jié)晶紫購于上海麥克林生化科技有限公司，CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、一抗Bcl-2、Bax、cyclin D1、GAPDH及二抗均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌Bel-7402細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中放于恒溫培養(yǎng)箱(5%CO2、37 ℃)中常規(guī)傳代培養(yǎng)，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌Bel-7402細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別予以含低濃度KA(25 μmol/L)、中濃度KA(50 μmol/L)、高濃度KA (100 μmol/L)的培養(yǎng)液處理，對(duì)照組給予含等量二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)液處理。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 采用CCK-8試劑盒檢測(cè)KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞接種于96孔板中，分組及干預(yù)方法同1.2.2，培養(yǎng)24、48、72 h后，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 h每孔加入CCK-8溶液10 μl培養(yǎng)2 h，再用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402細(xì)胞，以約1000個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞分組及干預(yù)同1.2.2，置于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d左右，然后以4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗后結(jié)晶紫染色15 min，雙蒸水漂洗后置于空氣中干燥，最后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力的檢測(cè) 采用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)KA對(duì)Bel-7402肝癌細(xì)胞的遷移能力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液,鋪于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后，在每孔底部劃出3條均勻豎線，PBS洗滌2次后于倒置顯微鏡下觀察作為0時(shí)狀態(tài)，并標(biāo)記每個(gè)觀察點(diǎn)，再更換為含不同濃度KA(0、25、50、100 μmol/L)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時(shí)間(24、48 h)在倒置顯微鏡下拍照，記錄同一個(gè)觀察點(diǎn)劃痕寬度的變化，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)遷移率。

1.2.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室檢測(cè)KA對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。無菌條件下Matrigel(基質(zhì)膠)于冰浴融化，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成1 g/L，取50 μl鋪于Transwell上室，Transwell下室每孔加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，上室加入Bel-7402肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/ml，每孔50 μl，設(shè)KA低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，分組后加入不同濃度的KA(25、50、100 μmol/L)及溶媒DMSO對(duì)上室細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)24 h后，去除上室中培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去上層中的細(xì)胞，4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗滌2次，結(jié)晶紫染色15 min，再用PBS洗滌，在倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)穿過小室的細(xì)胞。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax、CyclinD1及GADPH蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402細(xì)胞接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為含有不同濃度KA(0、25、50、100 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞并將各組細(xì)胞裂解，按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，使用BCA法測(cè)量蛋白濃度并定量。將定量后的各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取等量總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜置于用PBST配制的含5%脫脂奶粉的蛋白封閉液中封閉2 h，一抗孵育過夜(4 ℃)。次日PBST避光漂洗3次后二抗室溫孵育1.5 h，PBST漂洗3次，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖的影響 各組處理Bel-7402細(xì)胞24、48、72 h后，Bel-7402細(xì)胞的對(duì)照組和低、中、高濃度組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力為24 h：(100.00±2.72)%、(75.70±2.42)%、(62.79±2.45)%、(43.41±2.11)%; 48 h：(100.00±2.81)%、(71.19±3.13)%、(53.53±3.44)%、(39.44±3.60)%; 72 h: (100.00±4.06)%、(72.65±3.32)%、(52.42±1.70)%、(34.12±1.41)%。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各實(shí)驗(yàn)組Bel-7402細(xì)胞的相對(duì)活力均明顯下降(P值均<0.05)(圖1)。

2.2 KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞克隆形成的影響 對(duì)照組和低、中、高濃度組Bel-7402細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為：923.3±35.2、682.7±24.4、464.0±22.0、327.3±14.0。相比于對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組Bel-7402細(xì)胞的克隆形成數(shù)目呈劑量依賴性減少(P值均<0.05)(圖 2)。

2.3 KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞遷移能力的影響 對(duì)照組和低、中、高濃度組Bel-7402細(xì)胞的相對(duì)遷移率在24 h為：(100.00±1.11)%、(63.33±1.16)%、(51.72±3.23)%、(37.18±2.71)%；48 h為：(100.00±2.90)%、(58.12±2.80)%、(36.81±3.19)%、(36.39±3.30)%。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組在24 h和48 hBel-7402細(xì)胞的遷移能力均顯著下降(P值均<0.05)(圖3)。

2.4 KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞侵襲能力的影響 各組處理細(xì)胞24 h后，對(duì)照組和低、中、高濃度組穿過Transwell小室的Bel-7402細(xì)胞數(shù)目分別為212.0±3.0、134.0±2.0、71.0±2.0、34.0±1.0。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P值均<0.05)(圖4)。

2.5 KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 各組處理細(xì)胞48 h后，Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組下調(diào)了Bel-7402細(xì)胞中抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)(P值均<0.05)，上調(diào)了Bel-7402細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)(P值均<0.05)，且下調(diào)了Bel-7402細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)(P值均<0.05)(圖5，表1)。

表1 各組Bel-7402細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

3 討論

肝癌是全世界最常見的侵襲性癌癥之一[7]，大多數(shù)肝癌患者早期癥狀不明顯，確診時(shí)已是晚期，已不再適合采用手術(shù)切除方式治療[8]。由于肝癌內(nèi)在的藥物代謝活性，使其對(duì)化療存在一定的抵抗性[9]，且常規(guī)化療藥物長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)和耐藥性，也限制了其在臨床上的應(yīng)用。KA因其抗炎、抗氧化等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)受到越來越多的關(guān)注，有研究[10]表明山萘酚通過下調(diào)microRNA-21的表達(dá)，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，還有研究[11]顯示KA通過AMPK及AKT途徑誘導(dǎo)自噬，對(duì)肝癌SK-HEP-1細(xì)胞產(chǎn)生抗增殖作用。但肝癌由于致病因素多變導(dǎo)致了不同患者間的異質(zhì)性[12]，在肝癌的進(jìn)展過程中體內(nèi)微環(huán)境的變化會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)其體內(nèi)肝癌細(xì)胞發(fā)生變異，產(chǎn)生更多細(xì)胞克隆亞型[13]，從而導(dǎo)致肝癌的高度異質(zhì)性，而高度異質(zhì)性是肝癌難以治療的主要原因之一，所以同一藥物對(duì)不同的肝癌細(xì)胞發(fā)揮的效應(yīng)及分子機(jī)制也不盡相同。KA對(duì)肝癌細(xì)胞的研究限于肝癌 HepG2和SK-HEP-1細(xì)胞等，且兩者抗癌效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制不一，故有關(guān)KA對(duì)于肝癌細(xì)胞的作用有必要進(jìn)一步探究。目前KA對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)用梯度濃度的KA分別處理肝癌Bel-7402細(xì)胞，與對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)KA干預(yù)后的Bel-7402細(xì)胞，其細(xì)胞活力、遷移及侵襲能力均受到明顯抑制。細(xì)胞凋亡是一種嚴(yán)格受基因調(diào)控的程序性死亡方式[14-15]，癌細(xì)胞通過多種方式異常激活抗凋亡蛋白的活性和抑制促凋亡蛋白活性[16]，從而逃避凋亡，該過程的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)是細(xì)胞周期的有序進(jìn)行，癌癥的難治愈性正是因異常的癌細(xì)胞周期而導(dǎo)致其無限增殖[17]，因此研究細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的調(diào)控因子是癌癥研究的重點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來探究KA的抗癌效應(yīng)。

Bax是一種促凋亡因子,而Bcl-2是抗凋亡因子，同屬Bcl-2基因家族, Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)控因素[18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度KA處理Bel-7402細(xì)胞后，出現(xiàn)Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)和Bax表達(dá)明顯上調(diào)的現(xiàn)象，提示KA可能通過抑制Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)Bax表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。CyclinD1是G1期細(xì)胞周期蛋白，在多種腫瘤中都有CylinD1的高表達(dá)。CyclinD1使下游的Rb蛋白磷酸化，從而釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖[19]。在本研究中，與對(duì)照組相比，不同濃度KA處理Bel-7402細(xì)胞后，CyclinD1蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)，提示KA可能通過抑制CyclinD1因子的表達(dá)使Bel-7402細(xì)胞阻滯于G1期, 從而抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞的快速增殖。

綜上所述，本研究表明KA能顯著抑制Bel-7402細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組均明顯上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2和CyclinD1的表達(dá)水平，表明KA可有效誘導(dǎo)肝癌Bel-7402細(xì)胞凋亡與抑制其增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控凋亡蛋白Bax/Bcl-2以及周期蛋白CyclinD1的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：仲富瑞、杜毅超、付文廣負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；程宦立、張浩、胡啟輝參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；夏先明等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。