王冰 舒易來(lái) 陳兵

鼓膜 (tympanic membrane，TM)是一種半透明的菲薄結(jié)構(gòu)，由角質(zhì)化的鱗狀上皮外層、纖維狀中層和粘膜內(nèi)層三層結(jié)構(gòu)組成[1]。造成鼓膜穿孔的最常見(jiàn)病因有外傷、中耳炎和鼓膜置管術(shù)遺留的造口等。雖然大多數(shù)急性鼓膜穿孔是可以自愈的，但面積較大的穿孔或慢性穿孔需要外科手術(shù)干預(yù)才能修復(fù)。穿孔的鼓膜如果不能及時(shí)愈合，失去了阻擋外界細(xì)菌進(jìn)入中耳的有效屏障，中耳感染的幾率將大大增加，嚴(yán)重者還會(huì)引起耳溢液、傳導(dǎo)性聽(tīng)力下降甚至膽脂瘤的形成等，造成嚴(yán)重的并發(fā)癥。鼓膜穿孔的自愈通過(guò)上皮細(xì)胞的移行而完成，但常缺少纖維中間層，相較于正常鼓膜，自愈后的鼓膜更加脆弱、傳聲性能不理想、較易形成內(nèi)陷袋，并且在一定的氣壓傷時(shí)有再次穿孔的可能。因此，重建類(lèi)似原生鼓膜的三層結(jié)構(gòu)是十分必要的。

目前，雖有多種鼓膜修補(bǔ)材料和術(shù)式可供選擇，但對(duì)于修補(bǔ)鼓膜的最佳材料仍未達(dá)成共識(shí)，鼓膜修復(fù)手術(shù)也存在一定的禁忌癥和并發(fā)癥[2]。常用的修復(fù)鼓膜穿孔的手術(shù)主要有鼓室成形術(shù)和鼓膜成形術(shù)，鼓膜成形術(shù)作為鼓室成形術(shù)的重要內(nèi)容之一，與其他手術(shù)，如：聽(tīng)骨鏈成形術(shù)等，組合構(gòu)成多種類(lèi)型的單純性鼓室成形術(shù)，也可與各種類(lèi)型的乳突切除術(shù)構(gòu)成多種類(lèi)型的乳突切除伴鼓室成形術(shù)。既往鼓膜修補(bǔ)使用的材料有消毒后的紙片、軟硅膠、脂肪或明膠海綿等，但這類(lèi)材料修復(fù)鼓膜的有效性存在差異[3，4]。目前最常見(jiàn)的是利用耳后顳肌筋膜或軟骨膜自體移植，成功率較高，但也有再次穿孔的可能[5]。

鼓室成形術(shù)多需在全身麻醉下完成，手術(shù)成本較高，顯微手術(shù)的難度對(duì)耳外科醫(yī)生也是一種挑戰(zhàn)[6]，術(shù)后發(fā)生鼓膜再次穿孔可能需要再次手術(shù)修復(fù)，反復(fù)自體取材可能還會(huì)導(dǎo)致供區(qū)的組織病變，使自體移植材料的可用性變差[7]。為了解決以上問(wèn)題，用于鼓膜修補(bǔ)的新型輔助材料和組織工程技術(shù)已應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床，以替代患者自體取材移植[4]。組織工程的基本方法包括支架結(jié)構(gòu)材料、生物因子和干細(xì)胞等；理想的支架材料可為細(xì)胞附著、生長(zhǎng)和發(fā)揮正常功能提供良好的環(huán)境，生物信號(hào)分子和生長(zhǎng)因子有助于增強(qiáng)細(xì)胞功能和促進(jìn)整體組織的生長(zhǎng)[8]。本文就鼓膜修補(bǔ)的組織工程學(xué)材料的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 結(jié)構(gòu)材料

通常結(jié)構(gòu)材料包括脫細(xì)胞組織和聚合物[1]，目前已有多種具有優(yōu)良特性的結(jié)構(gòu)材料供鼓膜穿孔修復(fù)手術(shù)選擇，比如：細(xì)胞外基質(zhì)、交聯(lián)水凝膠、蠶絲纖維蛋白等等。

1.1細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是天然來(lái)源的材料，由多細(xì)胞生物的細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，可以為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供具有誘導(dǎo)性的支架材料[8]，這些支架的結(jié)構(gòu)和功能蛋白可作為鼓膜重建和組織特異性修復(fù)的模板。

膀胱細(xì)胞外基質(zhì)可以用作鼓膜修補(bǔ)的組織工程支架材料。Parekh等[9]將豬的膀胱經(jīng)去細(xì)胞化處理產(chǎn)生膀胱基質(zhì)，然后作為貼片材料用于誘導(dǎo)鼓膜穿孔的修復(fù)；膀胱基質(zhì)貼片治療組和對(duì)照組(自然愈合組)愈合后的鼓膜均較原生鼓膜厚，但前者鼓膜組織學(xué)分析顯示為更透明、均勻的結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組自然愈合后的新生鼓膜有小囊泡和纖維結(jié)節(jié)等不均勻區(qū)域；由于樣本量較小，無(wú)法進(jìn)行有意義的統(tǒng)計(jì)分析。此外，此研究缺乏對(duì)細(xì)胞提取后獲取的膀胱基質(zhì)這一修補(bǔ)材料的表征描述和相關(guān)特性的研究。

Deng等[10]在2009年利用豬真皮和硬腦膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，獲得無(wú)細(xì)胞的ECM支架，然后從豚鼠鼓膜中分離鼓膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行接種，并且建立豚鼠鼓膜慢性穿孔的模型用于驗(yàn)證這種材料的有效性；顯微鏡下觀(guān)察和組織學(xué)檢查顯示，隨著時(shí)間推移該支架能成功誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)并使鼓膜愈合，并且組織切片染色結(jié)果顯示愈合的鼓膜具有與正常鼓膜相似的三層結(jié)構(gòu)，聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試也顯示修復(fù)后的聽(tīng)力有所提高[10]。隨著細(xì)胞提取技術(shù)的成功，脫細(xì)胞材料的生物相容性得到了充分的證明，異種生物材料可以用于鼓膜的組織工程學(xué)研究，利用此類(lèi)移植物材料也可以減少手術(shù)時(shí)間和成本。另外，有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)比脫細(xì)胞真皮與顳肌筋膜作為鼓膜移植物材料的療效[11]，對(duì)40例患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)非盲試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組采用厚度0.03 mm的脫細(xì)胞真皮、對(duì)照組采用顳筋膜修補(bǔ)鼓膜；結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組手術(shù)時(shí)間較對(duì)照組明顯縮短且術(shù)后疼痛也明顯減輕，同時(shí)兩組移植成功率及聽(tīng)力結(jié)果無(wú)明顯差異。這項(xiàng)研究將脫細(xì)胞真皮與臨床上最常用的自體組織作比較，十分有意義，但這項(xiàng)研究并非雙盲試驗(yàn)，并且使用脫細(xì)胞真皮之類(lèi)的新型移植物材料也存在著成本問(wèn)題。

1.2交聯(lián)水凝膠 目前為止，已有多種水凝膠和海綿材料應(yīng)用于組織工程學(xué)研究，此類(lèi)材料來(lái)源于糖胺聚糖，具有促進(jìn)傷口愈合和加速上皮化的能力，在修補(bǔ)組織缺損傷口的領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[12]。Park等[13]在豚鼠急性鼓膜穿孔模型中比較了多種合成交聯(lián)水凝膠的療效，分別為Carbylan-SX、Gelatin-DTPH-PEGDA、Carbylan-S/GelatinDTPH、明膠海綿、外延膜、交聯(lián)硫代硫酸軟骨素，結(jié)果表明Carbylan-S/Gelatin-DTPH水凝膠、明膠海綿和硫代硫酸軟骨素修復(fù)的鼓膜穿孔愈合時(shí)間最短，其中硫酸軟骨素修補(bǔ)組出現(xiàn)了較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。Hakuba等[14]用水凝膠結(jié)合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)對(duì)豚鼠急性鼓膜穿孔進(jìn)行修補(bǔ)，結(jié)果bFGF處理組修復(fù)率較高，并且形成了與原生鼓膜相似的三層結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組(生理鹽水組)僅有粘膜層和上皮層的再生。

1.3蠶絲 絲素是蠶絲中含有的一種具有彈性、可降解性和生物相容性的蛋白質(zhì)聚合物，這種特性使得蠶絲已被用于鼓膜組織工程學(xué)的支架材料研究[15, 16]。2010年，Ghassemifar等[15]在含血清培養(yǎng)基中，分別在蠶絲蛋白貼片(取自家蠶)和組織培養(yǎng)塑料薄膜(對(duì)照組)上培養(yǎng)人類(lèi)鼓膜細(xì)胞15天，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，蠶絲蛋白貼片支持的鼓膜細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)水平要高于對(duì)照組，并且免疫熒光化學(xué)分析明確表明，蠶絲蛋白貼片組支持的細(xì)胞之間的接觸與粘附情況也優(yōu)于對(duì)照組；所以認(rèn)為蠶絲蛋白是一種更適合于人類(lèi)鼓膜細(xì)胞的支架材料，可以應(yīng)用于鼓膜組織工程學(xué)研究[15]。但是上述研究?jī)H限于體外細(xì)胞的培養(yǎng)，而缺乏有效的體內(nèi)模型驗(yàn)證。Kim等[16]對(duì)大鼠急性鼓膜穿孔模型進(jìn)行修補(bǔ)處理，一側(cè)耳用蠶絲貼片修補(bǔ)，對(duì)側(cè)耳用紙貼片進(jìn)行修補(bǔ)，結(jié)果示蠶絲貼片與紙貼片處理的鼓膜穿孔平均愈合時(shí)間分別為7.2天和9.1天，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組織學(xué)分析顯示，蠶絲貼片修補(bǔ)組有與天然鼓膜更相似的結(jié)構(gòu)[16]。此外，Levin等[17,18]對(duì)絲素對(duì)鼓膜再生的影響進(jìn)行了研究，體外研究表明蠶絲貼片可以支持人類(lèi)鼓膜角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和粘附?？偟膩?lái)說(shuō)蠶絲可作為一種較為理想的天然材料用于鼓膜穿孔的修補(bǔ)。

2 影響鼓膜再生的生長(zhǎng)因子

目前已有多種生長(zhǎng)因子被廣泛用于鼓膜穿孔愈合的研究,其中被廣泛研究的生長(zhǎng)因子有表皮生長(zhǎng)因子[19～21]、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)[22～25]、透明質(zhì)酸(HA)[26,27]，且大多數(shù)研究表明，這些生物因子對(duì)鼓膜的再生有顯著療效。

2.1透明質(zhì)酸 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種具有粘彈性的天然胞外多糖物質(zhì)[28]。MeroGel 是一種商業(yè)可用的酯化透明質(zhì)酸,Ozturk等[29]建立大鼠急性鼓膜穿孔模型來(lái)評(píng)估MeroGel和HA的有效性,結(jié)果顯示，MeroGel和HA處理組的鼓膜穿孔愈合率明顯高于對(duì)照組，并且這兩組效果無(wú)明顯差異；免疫組化分析結(jié)果示，MeroGel和HA處理組的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)含量明顯升高，所以MeroGel被認(rèn)為是一種較為理想的鼓膜修補(bǔ)材料。

2.2表皮生長(zhǎng)因子 Ramalho等[30]在亞急性鼓膜穿孔的栗鼠模型中研究表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和己酮可可堿的作用，己酮可可堿是一種能夠增加局部微循環(huán)缺陷組織血流量和氧張力的藥物；實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(n=9)：外用蒸餾水；A組(n=8)：局部外用EGF；B組(n=13)：口服己酮可可堿，每12小時(shí)10 mg/kg，連續(xù)10天；D組(n= 10)：外用EGF + 己酮可可堿。每組每隔72小時(shí)給藥一次，持續(xù)10天，所有動(dòng)物均在鼓膜穿孔處放置可吸收的明膠海綿。結(jié)果鼓膜愈合率分別為：對(duì)照組8.7%，A組30.3%，B組3.6%，D組16.5%，提示EGF促進(jìn)了鼓膜愈合，但是己酮可可堿沒(méi)有顯示出積極的結(jié)果，EGF和己酮可可堿之間也并無(wú)協(xié)同作用。此外，還有研究[31]對(duì)大鼠進(jìn)行急性鼓膜穿孔造模后，分別用浸泡過(guò)透明質(zhì)酸和EGF的明膠海綿修復(fù)穿孔，結(jié)果顯示，與自然愈合的鼓膜穿孔相比，HA和EGF明顯縮短了鼓膜愈合的時(shí)間，但是HA和EGF兩組間差異不顯著；在組織病理學(xué)檢查中，治療組與對(duì)照組在鼓膜厚度、新生血管生成等方面亦無(wú)明顯差異?？梢?jiàn)，表皮生長(zhǎng)因子能夠有效促進(jìn)鼓膜穿孔的愈合。

2.3血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF) 血小板源性生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endogrowth factor, VEGF)形成了一個(gè)具有高度保守性的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域，目前在鼓膜修補(bǔ)方面，關(guān)于PDGF和VEGF的研究還較為有限。Yeo等[32]研究了PDGF在鼓膜穿孔修補(bǔ)中的應(yīng)用，分別用PDGF(實(shí)驗(yàn)組)和磷酸鹽緩沖液(對(duì)照組)處理大鼠急性鼓膜穿孔，結(jié)果示PDGF組穿孔鼓膜較對(duì)照組更快愈合，且組織學(xué)檢查顯示PDGF組處理后的新生鼓膜更接近原生鼓膜的三層結(jié)構(gòu)。Roosli等[33]首次在臨床試驗(yàn)中研究PDGF對(duì)鼓膜再生的作用，對(duì)20例鼓膜穿孔患者隨機(jī)進(jìn)行PDGF局部治療(用PDGF浸泡的消毒紙片處理穿孔鼓膜)和安慰劑治療，治療6周，結(jié)果顯示PDGF治療組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯示任何優(yōu)勢(shì)。血小板源性生長(zhǎng)因子對(duì)鼓膜穿孔愈合的研究目前較為有限，還有待更多的探索。

3 干細(xì)胞

用于鼓膜生物工程研究的細(xì)胞可以從原始組織、細(xì)胞系或干細(xì)胞中獲得，這些細(xì)胞可以在植入前注射或在體外植入[34]。目前，用于生物支架研究的細(xì)胞研究較為有限,除了上述已提及的Deng等[10]的研究外，von Unge等[35]在沙鼠急性鼓膜穿孔模型中，應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞處理鼓膜穿孔，結(jié)果顯示小鼠胚胎干細(xì)胞能夠改善鼓膜愈合。然而，當(dāng)此法應(yīng)用于大鼠模型中時(shí)，未發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞對(duì)鼓膜穿孔愈合起到促進(jìn)作用； 6個(gè)月后觀(guān)察修復(fù)后的鼓膜，處理組和未處理組新生鼓膜強(qiáng)度和剛度相似，但干細(xì)胞處理組鼓膜中層較厚[36]。隨后，此研究組又進(jìn)一步將人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于豚鼠慢性鼓膜穿孔模型，結(jié)果顯示人間充質(zhì)干細(xì)胞處理后的鼓膜穿孔愈合率為40%，未處理組愈合率僅為10%；但免疫抑制劑(他克莫司)處理組呈現(xiàn)出愈合不良，并且中耳腔充滿(mǎn)了炎性肉芽和組織粘連[37]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的鼓膜祖細(xì)胞在鼓膜臍部、鼓環(huán)以及錘骨柄部位，表明這些部位具有再生鼓膜干細(xì)胞的可能[38]。

干細(xì)胞在促進(jìn)鼓膜再生方面顯示出了巨大潛能，經(jīng)過(guò)處理的干細(xì)胞結(jié)構(gòu)與原生鼓膜的結(jié)構(gòu)似乎十分相似，這對(duì)于鼓膜修復(fù)、重建聽(tīng)功能和防止再次穿孔至關(guān)重要。然而，干細(xì)胞治療也存在倫理和成本方面的問(wèn)題；因此，未來(lái)其他來(lái)源的細(xì)胞，如：自體角質(zhì)形成細(xì)胞也將成為重要研究方向。

4 展望

總的來(lái)說(shuō)，各種原因?qū)е碌墓哪ご┛自谂R床上十分常見(jiàn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前對(duì)鼓膜穿孔修復(fù)的研究包括生物材料、生物因子、干細(xì)胞以及各種術(shù)式的選擇，存在各種挑戰(zhàn)，比如：生物材料的性能有待優(yōu)化，從而能適配鼓膜原有的生物力學(xué)和聲學(xué)特性；脫細(xì)胞基質(zhì)的選擇可能會(huì)涉及倫理問(wèn)題，需要對(duì)患者充分告知；各種修復(fù)材料等尚需要進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。隨著各種新型材料的出現(xiàn)和改進(jìn)，各種研究的不斷深入和臨床應(yīng)用終將對(duì)這一領(lǐng)域帶來(lái)光明的前景。