方 一（綜述） 陳 健 吳海濤（審校）

（復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200031）

頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第6位，其中以頭頸部鱗狀細胞癌（簡稱頭頸鱗癌）為主，2012年全球范圍內(nèi)共造成約78萬人死亡，占癌癥總死亡率的10%［1］。隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展和檢測技術(shù)的進步，早期診斷的頭頸鱗癌患者生存率可高達75%～80%，但大部分患者直到晚期才被確診，遠期生存率僅為35%［2］。早期診斷成為提高頭頸鱗癌患者生存率的關(guān)鍵之一。癌前病變是指特定器官存在的良性病變，易出現(xiàn)細胞異常增生，具有惡變傾向，對于監(jiān)測惡性腫瘤的發(fā)生具有重要的意義［3］。DNA甲基化是一種針對DNA 5'端核苷酸胞嘧啶的共價修飾，可以在不改變基因序列的前提下調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄活性等，并保護DNA位點不被特定限制酶降解，是目前已知表觀遺傳學中DNA修飾的唯一方式［4］。已有大量研究證明DNA甲基化與腫瘤有關(guān)，且多發(fā)生在腫瘤生成的早期階段，并參與惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移［5-6］，根據(jù)腫瘤甲基化數(shù)據(jù)庫 PubMeth（www.pubmeth.org），常 見 的 與DNA甲基化有關(guān)的腫瘤是肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、白血病、腦瘤、肝癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在頭頸部腫瘤中的研究相對較少。因此，本文對DNA甲基化在頭頸鱗癌中的作用進行綜述。

DNA甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用1950年Wyatt等［7］首次報道真核細胞中存在核酸甲基化的現(xiàn)象。1983年Feinberg等［8］系統(tǒng)總結(jié)了腫瘤細胞中DNA甲基化的情況，并使該領(lǐng)域得到重視。DNA甲基化通過共價化學修飾在5'端胞嘧啶添加甲基基團，通常導致基因位點的沉默。除少數(shù)位于5'-CA-3'和5'-CT-3'序列，甲基化最常發(fā)生在5'-CG-3'序列中（也被稱為CpG二核苷酸）。人類基因組中大部分序列中存在DNA甲基化現(xiàn)象，約每100 kb會出現(xiàn)長度為0.5～5 kb的特殊區(qū)域，其中富含未甲基化的CG序列（60%～70%），被稱為CpG島。CpG島存在于人類基因組大半的基因轉(zhuǎn)錄起始位點，即主要位于中高度轉(zhuǎn)錄活性或者保持靜止的基因，如管家基因和組織特異性基因。因而基因組、尤其是CpG島內(nèi)的異常甲基化將會改變序列表達的起始位置，進而導致表型的改變。

腫瘤細胞中的異常DNA甲基化常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期階段，基因位點過甲基化和全基因組低甲基化的特點，其中對過甲基化的研究遠多于后者。多項針對腫瘤過甲基化的研究證明其通常與抑癌基因的沉默有關(guān)，進而導致細胞周期、細胞凋亡或基因穩(wěn)定性的改變。Flavahan等［9］發(fā)現(xiàn)，異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）的原發(fā)突變通過影響10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白，使得鎘離子結(jié)合蛋白質(zhì)CTCF結(jié)合位點出現(xiàn)過甲基化，進而激活成瘤基因血小板源性生長因子受體α多肽，促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生。另一項關(guān)于小細胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）的研究指出，RAS相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）位點是防止細胞產(chǎn)生干細胞樣增殖的“天然屏障”，而40%SCLC患者中存在RASSF1A位點內(nèi)增強子的異常甲基化，導致該位點沉默，失去其腫瘤抑制作用［10］。

腫瘤全基因組的低甲基化狀態(tài)同樣在惡性腫瘤中普遍存在。目前認為低甲基化狀態(tài)下成瘤基因更易被激活，從而促進腫瘤生成。Wu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，全長配對盒基因2是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞增殖和生長的關(guān)鍵性基因，其因在子宮內(nèi)膜癌中的異常激活而被認為是成瘤基因，并與他莫昔芬的耐藥有關(guān)，而該位點增強子的異常激活已被證實與腫瘤相關(guān)低甲基化有關(guān)。其次，低甲基化導致的活動性DNA信息載體異常與腫瘤相關(guān)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制子觸發(fā)胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA（dsDNA）受體，從而促進異常細胞的凋亡，而敲除該受體則會促進卵巢癌、惡性黑色素瘤和其他腫瘤的進展［12］。動物實驗提示DNA低甲基化引起的染色體不穩(wěn)定性也是導致腫瘤發(fā)生的原因之一，這可能與逆轉(zhuǎn)座子LINE-1的去甲基化有關(guān)［13］。

DNA甲基化與頭頸部腫瘤相關(guān)易感因素的關(guān)系表觀遺傳信息受到基因組序列、環(huán)境暴露和隨機因素的影響，其中環(huán)境因素暴露已成為研究熱點。吸煙、長期酗酒、病毒感染是頭頸部腫瘤共同的易感因素，會導致DNA甲基化改變，促進腫瘤發(fā)生。

吸煙主要通過以下4個方面影響DNA甲基化：（1）破壞DNA結(jié)構(gòu)。煙草中含有近60種致癌物，其中氮雜芳烴、亞硝胺、氨基甲酸乙酯、環(huán)氧乙烷等可導致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，在DNA的修復過程中招募的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）對臨近 CpGs進行錯誤甲基化［14］；（2）尼古丁影響DNA甲基化水平。尼古丁激活cAMP相關(guān)信號通路的同時，也具有下調(diào)DNMT1表達水平的作用，從而改變基因組的甲基化［15］；（3）影響 DNA結(jié)合因子間接改變甲基化。吸煙可以上調(diào)細胞內(nèi)刺激蛋白Sp1的表達，后者與富含CG的基因增強子模塊結(jié)合，從而阻止CpG島發(fā)生從頭甲基化［16］；（4）局部組織缺氧激活甲基化。吸煙會導致組織微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，一方面激活HIF-1α依賴通路，促進合成甲基轉(zhuǎn)移酶，另一方面抑制TET蛋白活性［17］，從而影響DNA甲基化水平。

酗酒對DNA甲基化的影響主要與S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAMe）及一碳單位代謝通路（one-carbon metabolism）有關(guān)。一碳單位代謝的實質(zhì)是將SAMe上的甲基化基團通過一系列反應轉(zhuǎn)移至DNA等其他化合物上，而酒精可以干擾其中多個酶的功能，從而導致DNA甲基化水平的改變。酒精可以抑制蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine adenosyl transferase，MAT），從而減少SAMe生成，同時可以抑制DNMT，致使SAMe上的甲基基團無法進入循環(huán)；5-甲基四氫葉酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶受到酒精抑制后，5-甲基四氫葉酸無法脫甲基為四氫葉酸，從而使碳單位循環(huán)受阻［18］。酗酒導致葉酸、維生素B12等營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙［19］，一碳單位代謝受到抑制、DNA的不穩(wěn)定性增加并導致異常的甲基化狀態(tài)，從而促使腫瘤發(fā)生。

病毒感染在頭頸部腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視，其中以人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和 EB 病 毒（Epstein-Barr virus，EBV）最為典型［20］。Zhao 等［21］報道頭頸部腫瘤中作為甲基化“清除器”的TET甲基化系數(shù)與HPV感染狀況存在相關(guān)性，研究認為EBV相關(guān)鼻咽癌患者中ITGA4、RERG和ZNF671基因的甲基化可以區(qū)分腫瘤與正常組織，其中的病毒作用機制仍未明確，病毒可能通過調(diào)節(jié)宿主細胞DNA甲基化來抵御抗病毒免疫，改變免疫微環(huán)境［22］。

與頭頸鱗癌相關(guān)的DNA甲基化位點頭頸鱗癌發(fā)病隱匿，常因不能早期診斷而延誤治療，基因甲基化為惡性腫瘤早期改變的特點之一，因此成為潛在的篩查生物標志。根據(jù)功能改變，基因位點可分為以下4類：（1）加快細胞周期促進增殖。RASSF1A是人類腫瘤中最常見的表觀修飾位點之一［23］，其失活可促進下游 microRNA 21 表達、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）激活并消除p21和p27的抑制作用，從而促進細胞增殖［24］；細胞周期依賴性激酶抑制基因2A（CDKN2A）又稱為p16基因，通過pRb-E2F通路在G1-S轉(zhuǎn)換階段負性調(diào)節(jié)細胞周期進程，其甲基化改變將會導致腫瘤異常增殖［25］；甘丙肽受體 1（galanin receptor，GALR1）和p15、p21基因［26］的甲基化與細胞循環(huán)相關(guān)；（2）抑制細胞凋亡。死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一種鈣相關(guān)調(diào)節(jié)因子，可以通過p19ARF/p53通路調(diào)節(jié)細胞凋亡，在包括頭頸部腫瘤在內(nèi)的多種癌癥中存在異常甲基化［27］；速激肽1編碼P物質(zhì)和神經(jīng)激肽A可以通過激活ERK1/2和 NF-κB 信號通路促進增殖和抗凋亡［28］；隔膜蛋白9、鈉碘轉(zhuǎn)運體蛋白8、染色體18上功能性smad抑制部分（FUSSEL18）、早期B細胞因子3及IRX1可通過影響轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TNFβ）干擾腫瘤凋亡［29］；（3）影響DNA修復。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methyguanine-DNA methytransferase，MGMT）是一種對烷化劑造成的DNA損傷敏感的DNA修復酶，其可在接受烷化劑類化療藥治療時保護正常細胞、防止二次癌變，但也會影響此類藥物對腫瘤的效果［30］。MGMT過甲基化導致表達下降與頭頸鱗癌有關(guān)，并具有雙向作用，一方面促進腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，同時也降低其對化療的耐藥性［31］；（4）促進遠處轉(zhuǎn)移。正常上皮細胞通過形成E鈣黏蛋白（E-cadherin）-β連蛋白（β-catenin）復合物與其他細胞及基底膜相黏附，而頭頸鱗癌中該位點的低表達與腫瘤局部侵襲及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為預后指標［32］；Ⅰ型膠原α2鏈是大部分組織連接處的纖維成分，其過甲基化同樣導致增殖和轉(zhuǎn)移增加［33］。

靶向DNA甲基化的治療方案與基因突變不同，DNA甲基化為可逆性改變，體外實驗證明逆轉(zhuǎn)過甲基化的DNA位點能使其重新獲得功能［34］。目前已有十余種抗甲基化藥物得到美國FDA批準或處于臨床實驗，按其作用機制可分為廣譜藥物和靶向藥物。DNMT抑制劑是經(jīng)典的廣譜抗甲基化藥物，可以造成廣泛去甲基化，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤特異性改變［35］。阿扎胞苷（5-azacytidine）、地西他濱（5-aza-2'-deoxycytidine）等藥物抑制腫瘤的作用在臨床試驗中已得到驗證［34］。目前靶向DNA甲基化的藥物較少，IDH抑制劑AG-881、IDH305等可以穩(wěn)定三羧酸循環(huán)、干擾TET及組蛋白的異常甲基化，在急性髓細胞白血病中起到積極作用［36］。但去甲基化藥物的臨床應用也存在風險，廣泛去甲基化引起的基因不穩(wěn)定性可能會導致細胞凋亡，甚至促進成瘤基因的激活［37］。研究提示特異基因去甲基化可以改善化療藥物的耐藥性［38］，與化療、免疫治療等組成聯(lián)合方案是目前去甲基化治療的最佳方法。

結(jié)語DNA的異常甲基化（包括全基因序列的低甲基化和抑癌基因的高甲基化），在腫瘤發(fā)生中起到重要的作用。吸煙、長期酗酒、病毒感染被認為是頭頸部腫瘤的易感因素，可以通過多種途徑促進異常甲基化的發(fā)生，進而誘發(fā)正常組織癌變。目前針對 RASSF1A、CDKN2A、DAPK、MGMT、E-cadherin等位點的研究可能為完全揭示甲基化導致腫瘤發(fā)生的機制提供線索。液態(tài)活檢技術(shù)的應用以及對癌前病變甲基化的監(jiān)測可為腫瘤早期診斷提供便利。結(jié)合化療、免疫治療的甲基化靶向治療有望為改善患者預后作出貢獻。