朱祖輝，邢偉*，劉海峰，2，王晴，杜亞楠，李宇峰，張記磊

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是長(zhǎng)期慢性肝實(shí)質(zhì)反復(fù)損傷-修復(fù)后肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，細(xì)胞外基質(zhì)彌漫性異常沉積的病理過程[1]。HF是慢性肝病的共同基礎(chǔ)，隨著HF進(jìn)展可出現(xiàn)終末期肝硬化甚至肝癌[2]，精準(zhǔn)分期并抗纖維化治療可有效阻遏甚至逆轉(zhuǎn)早期HF，因此，HF準(zhǔn)確分期對(duì)指導(dǎo)治療方式及患者預(yù)后判斷具有十分重要的意義[3-4]。肝穿刺活檢雖然是臨床診斷HF的金標(biāo)準(zhǔn)，但是25%～40%的病人會(huì)產(chǎn)生疼痛，0.3%～0.6%的病人出現(xiàn)出血，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致死亡[5]，因此尋求無創(chuàng)、有效的HF診斷及分期的方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

釓塞酸二鈉(gadolinium ethoxybenzyl diethylenetriamine pentaacetic acid，Gd-EOB-DTPA)兼具細(xì)胞外間隙及肝細(xì)胞對(duì)比劑特性[6]，基于Gd-EOBDTPA的磁共振縱向弛豫時(shí)間成像(T1 mapping)不僅可通過直接測(cè)量增強(qiáng)前后的T1值的變化反映對(duì)比劑分布情況，還可以通過間接測(cè)量肝細(xì)胞外容積(extracellular volume fraction，ECV)變化反映HF時(shí)細(xì)胞外體積變化[7-8]，所以T1 mapping具有量化HF的潛在優(yōu)勢(shì)。因此，本研究擬探討基于Gd-EOB-DTPA的T1 mapping成像技術(shù)定量評(píng)估HF的價(jià)值，為HF無創(chuàng)診斷及治療提供影像學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。前瞻性納入100只新西蘭雌性健康大白兔(蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，6月齡，體重2.0～2.6 kg，隨機(jī)分為HF組(n=80)和正常對(duì)照組(n=20)。HF組通過頸背部皮下注射50%CCl4油溶液(100%CC14與橄欖油1∶1混合)，每周注射1～2次，第1～3周劑量0.1 mL/kg，第4～6周劑量0.2 mL/kg，第7～10周劑量0～3 mL/kg；對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔接受同劑量、等頻率的生理鹽水注射。

1.2 MRI掃描方案

MR掃描采用Philips Ingenia 3.0 T超導(dǎo)磁共振掃描儀，18通道相控陣膝關(guān)節(jié)線圈。掃描前兔禁食12 h，肌注水合氯醛4 mL/kg，仰臥位下用腹帶固定腹部抑制呼吸。在第4、5、6、15周末隨機(jī)選取HF組20只及對(duì)照組5只兔行軸位肝臟MRI掃描：①軸位T1WI；重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間=400/18 ms，翻轉(zhuǎn)角=90°，層厚=4 mm，層間距=0.4 mm。②采用改良Look Locker 序列分別于增強(qiáng)前、增強(qiáng)后10、20 min獲取T1 mapping圖像：重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間=3/1 ms，翻轉(zhuǎn)角=20°，層厚=4 mm，層間距=0.4 mm。

1.3 圖像分析

所有圖像均傳送至Philips工作站，由兩位腹部影像研究方向的醫(yī)師在雙盲前提下對(duì)獲取的MR圖像分別進(jìn)行獨(dú)立分析，如遇分歧則通過討論解決。在T1native、T110min、T120min的圖像上避開肝血管、膽管、肝臟邊緣后，分別在肝左、中、右葉勾畫ROI，ROI面積為15～20 mm2，獲取的參數(shù)平均值作為最后肝臟的T1native、T110min、T120min的定量參數(shù)值。最后，通過公式獲取ECV參數(shù)值，ECV=(1/LT1post-1/LT1native)/(1/AT1post-1/AT1native)×(1-HCT)，其中T1native為增強(qiáng)前肝臟T1值，T1post為增強(qiáng)后(10、20 min)T1值，AT1native為腹主動(dòng)脈增強(qiáng)前T1值，AT1post為腹主動(dòng)脈增強(qiáng)后(10、20 min)的T1值，HCT為血細(xì)胞比容(hematocrit)。

1.4 病理學(xué)檢查

掃描后利用空氣栓塞致死實(shí)驗(yàn)兔，取兔肝臟10%福爾馬林溶液浸泡，甲醛固定后制石蠟切片，行Masson染色后兩名富有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師于顯微鏡下進(jìn)行Metavir分期：F0：無HF；F1：門靜脈匯管區(qū)擴(kuò)大，局限竇周、小葉內(nèi)纖維化；F2：匯管區(qū)周圍纖維化或少量間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；F3：大量纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；F4：肝硬化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和MedCalc 18.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)計(jì)量資料是否符合正態(tài)分布，正態(tài)分布數(shù)據(jù)則用±s表示。采用Spearman相關(guān)性分析各定量參數(shù)值(T1native、T110min、T120min、ECV10min、ECV20min)與HF分期的相關(guān)性，并以相關(guān)系數(shù)r值的絕對(duì)值大小表示相關(guān)性高低，|r|＞0.7、|r|=0.4～0.7、|r|=0.2～0.4分別代表強(qiáng)、中等、弱相關(guān)，|r|＜0.2表示無相關(guān)性。使用單因素方差分析的LSD方法比較各HF分期之間定量參數(shù)值的差異性。應(yīng)用ROC曲線方式分析各定量參數(shù)值鑒別診斷 F0 vs F1-F4(≥F1)，F(xiàn)0-F1 vs F2-F4(≥F2)，F(xiàn)0-F2 vs F3-F4(≥F3)，F(xiàn)0-F3 vs F4(F4)的價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔HF模型和病理學(xué)結(jié)果

在初步納入的100只實(shí)驗(yàn)兔中，7只HF兔因CC14不耐受死亡，3只HF組和3只正常對(duì)照組兔麻醉時(shí)意外死亡而排除，2只正常對(duì)照兔因呼吸運(yùn)動(dòng)偽影造成的T1 mapping圖像質(zhì)量較差而未納入，最終HF建模成功及完成MR掃描 85只。如表1所示，F(xiàn)0、F1、F2、F3、F4期分別為14、19、15、19、18只。HF病理特征及T1 mapping圖像如圖1所示。

2.2 T1 mapping定量參數(shù)與HF進(jìn)展相關(guān)性

如圖2所示，T120min、ECV20min隨著HF進(jìn)展均呈明顯正相關(guān)(r=0.818、0.766，P＜0.001)，T1native和T110min與HF進(jìn)展有中等正相關(guān)(r=0.685、0.428，P＜0.001)，而ECV10min呈現(xiàn)出弱相關(guān)性(r=0.278，P=0.01)。

2.3 不同分期T1 mapping定量參數(shù)值比較

如表1所示，正常對(duì)照組和HF組(F1-F4)5個(gè)定量參數(shù)值(T1native、T110min、T120min、ECV10min、ECV20min)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。除F1 vs F2和F3 vs F4期，其余各期HF組兩兩比較T1native差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。T110min在F0 vs F2，F(xiàn)1 vs (F2、F3、F4)，F(xiàn)3 vs F4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余各組T110min差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；T120min可有效鑒別除F0 vs F1外的其余各HF組；除F0 vs F4期ECV10min值有明顯差異外(P＜0.05)，其余各組ECV10min兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于ECV20min值，除F0 vs F1，F(xiàn)2 vs F3期ECV20min值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其余各組ECV20min值兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 不同HF分期T1 mapping及ECV參數(shù)值Tab. 1 Summary values of T1 mapping and ECV parameters in different HF stages

表2 T1 mapping參數(shù)值鑒別診斷HF分期的效能Tab. 2 Efficiency of T1 mapping parameters in differenting HF stages

2.4 ROC曲線分析

T120min鑒別診斷≥F1、≥F2、≥F3、≥F4的AUC分別為0.90、0.93、0.93、0.92，整體高于ECV20min(AUC=0.85、0.89、0.89、0.95)和T1native(AUC=0.98、0.81、0.85、0.76)，T110min(AUC=0.80、0.68、0.76、0.66)及ECV10min(AUC=0.65、0.65、0.66、0.65)診斷價(jià)值較低，如表2和圖3所示。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)背景

前期研究證實(shí)通過直接測(cè)量Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI肝臟信號(hào)強(qiáng)度、肝脾信號(hào)比評(píng)價(jià)HF及肝功能損傷[9-10]，但肝臟信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)比劑濃度并不具備明顯線性相關(guān)性，且信號(hào)強(qiáng)度易受掃描序列、參數(shù)及技術(shù)的影響，導(dǎo)致通過直接測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度的方法評(píng)價(jià)HF及肝功能損傷存在爭(zhēng)議。T1弛豫時(shí)間是反映質(zhì)子縱向弛豫的絕對(duì)值并與對(duì)比劑濃度呈線性相關(guān)，因此基于T1 mapping成像測(cè)量的肝臟T1弛豫時(shí)間比直接測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度更客觀、穩(wěn)定，還可以直接用于不同時(shí)間點(diǎn)采集序列之間的比較[7，11]。

3.2 T1 mapping各參數(shù)值結(jié)果以及原因分析

3.2.1 T1native分析

本研究發(fā)現(xiàn)T1 mapping成像的平掃T1native參數(shù)值與HF進(jìn)展呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性并具有較高的診斷、鑒別診斷效能。T1native反映肝細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分及含量，HF時(shí)伴隨的慢性肝損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞功能障礙[12]，大量缺乏內(nèi)皮細(xì)胞的新生血管產(chǎn)生，纖維蛋白及紅細(xì)胞進(jìn)入ECV，肝臟的含水量增加，因此平掃T1native值與HF進(jìn)展呈增加趨勢(shì)，但T1native值難以有效鑒別診斷F1 vs F2和F3 vs F4期，推測(cè)原因是早期HF細(xì)胞外基質(zhì)沉積差異較小以及晚期HF伴隨的鐵沉積干擾。

3.2.2 T110min及T120min分析

Gd-EOB-DTPA是肝細(xì)胞特異性對(duì)比劑，較常規(guī)非特異性肝對(duì)比劑可被肝細(xì)胞膜上有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transport polypeptide，OATP)攝取進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)[13]。Zhou等[14]和Sheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)基于Gd-EOB-DTPA的T1 mapping成像可有效鑒別診斷HF和評(píng)價(jià)肝功能損傷，這主要是由于隨著HF進(jìn)展導(dǎo)致的進(jìn)行性、功能性肝細(xì)胞受損、數(shù)量減少，OATP表達(dá)減低[15]，加之膠原纖維在細(xì)胞外間隙沉積導(dǎo)致Gd-EOBDTPA單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入肝細(xì)胞的量越少，從而引起肝細(xì)胞攝取Gd-EOB-DTPA減少。Gd-EOB-DTPA隨著HF進(jìn)展吸收減少，必然導(dǎo)致磁共振對(duì)比劑縮短肝臟T1的效能減低，因此T1 mapping增強(qiáng)后T110min、T120min值隨著HF進(jìn)展呈增加趨勢(shì)。

3.2.3 T110min及T120min分析診斷價(jià)值比較

但是，比較分析增強(qiáng)后10、20 min的T1值鑒別診斷HF的國(guó)內(nèi)外研究未見報(bào)道。目前認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)的肝膽期是在注射對(duì)比劑后20～40 min[16]，本研究對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)各期T120 min值雖然較T110min值低，但呈現(xiàn)出更高的正相關(guān)性，且鑒別診斷各期HF的價(jià)值(AUC=0.90、0.93、0.93、0.92)高于T110min值(AUC=0.80、0.68、0.76、0.66)，提示T120min值成像更適用于評(píng)價(jià)HF進(jìn)展。這主要是與Gd-EOB-DTPA藥代動(dòng)力學(xué)有關(guān)：Gd-EOB-DTPA在20 min時(shí)的肝特異期可進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞隨著HF進(jìn)展OATP受損、減少?gòu)亩餑d-EOB-DTPA吸收減少，加之在對(duì)比劑注射20 min后Gd-EOB-DTPA被肝細(xì)胞特異性吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外間隙內(nèi)對(duì)比劑相比T110min更少，從而導(dǎo)致肝臟T1值進(jìn)一步減低，因此各期HF的T120min值較T110min值小。而10 min時(shí)仍處于Gd-EOB-DTPA由細(xì)胞外間隙吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過程中，因此T120min相比于T110min加大了各HF分期的T1值的差距，所以T120min鑒別診斷HF的價(jià)值更高，提示T120min值更適用于診斷及鑒別診斷HF，為今后肝臟Gd-EOBDTPA增強(qiáng)磁共振成像診斷HF時(shí)間點(diǎn)的選擇提供了影像學(xué)依據(jù)。

3.2.4 ECV10min及ECV20min分析

通過測(cè)量T1 mapping成像增強(qiáng)前后T1值的變化得出的ECV值能反映組織內(nèi)對(duì)比劑分布，且不受患者心率快慢、磁共振對(duì)比劑計(jì)量、血細(xì)胞比容的影響。 既往研究證實(shí)ECV值能無創(chuàng)性有效評(píng)估心肌纖維化、心肌水腫及淀粉樣變[11，17]，但關(guān)于Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)后10、20 min的ECV值評(píng)價(jià)HF的研究未見報(bào)道。ECV值反映肝臟細(xì)胞外間隙大小，隨著HF進(jìn)展，膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)沉積引起細(xì)胞外體積增大，因此ECV參數(shù)值與HF進(jìn)展存在理論上的正相關(guān)。本研究除證實(shí)ECV10min和ECV20min與HF進(jìn)展具有正相關(guān)性于上述理論相符外，還提示ECV20min鑒別診斷各期HF的價(jià)值高于ECV10min，這主要可能是由于10 min時(shí)Gd-E0BDTPA在細(xì)胞外間隙殘留加上HF伴隨的炎癥水腫、鐵沉積[18-19]引起細(xì)胞外間隙不穩(wěn)定導(dǎo)致ECV10min診斷HF價(jià)值較低。

3.3 不足與展望

本研究也存在以下不足：首先，由于相對(duì)較高的兔死亡率和嚴(yán)重的呼吸和運(yùn)動(dòng)偽影，最終只有85只兔納入研究，所以在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要防止高死亡率和避免嚴(yán)重的偽影。其次，由CCl4誘導(dǎo)的兔HF模型可能無法準(zhǔn)確反映人肝臟的病理變化。因此，需要在臨床研究中進(jìn)一步證實(shí)T1 mapping和ECV定量參數(shù)值鑒別診斷HF的價(jià)值。第三，HF的病理變化同時(shí)包含肝臟炎性反應(yīng)、脂肪變性及鐵沉積[20]，這些異質(zhì)性因素可能影響T1 mapping和ECV定量參數(shù)與HF相關(guān)性評(píng)價(jià)。

綜上所述，基于Gd-EOB-DTPA的增強(qiáng) T1 mapping 成像定量參數(shù)及ECV值與HF進(jìn)展密切相關(guān)，且對(duì)診斷及分期具有較大的診斷及鑒別診斷價(jià)值，可作為臨床HF分期、療效評(píng)估的有效影像學(xué)參數(shù)值。

利益沖突：無。