葉曼，鐘毅欣，汪星月，郭大靜，周君*

動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，而心血管疾病是一種嚴(yán)重影響和危害人類生命健康的疾病，有較高的致病率和致死率[1]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理特征、組成成分與斑塊的易損性、斑塊的破裂以及破裂后導(dǎo)致的嚴(yán)重后果息息相關(guān)[2]，因此，能夠在體無(wú)創(chuàng)性地檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的組成成分，將對(duì)患者的治療和預(yù)后評(píng)估有著極其重要的臨床價(jià)值。目前臨床常用的影像技術(shù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理成分及穩(wěn)定性判斷具有一定的局限性，而分子影像學(xué)的發(fā)展使得準(zhǔn)確地測(cè)定斑塊的組成成分成為可能，并且具有識(shí)別易損和高風(fēng)險(xiǎn)斑塊的潛能[3-4]，可以在疾病表現(xiàn)出臨床癥狀之前便提供相關(guān)的病理生理學(xué)信息。本研究用聚乳酸/羥基乙酸[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]作為載體，制備載配體硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)的磁共振及光聲雙模態(tài)分子探針，以期借助分子影像技術(shù)從細(xì)胞及分子水平分析動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的清道夫受體A (scavenger receptor A，SR-A)，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的早期精準(zhǔn)診斷，為疾病的治療及預(yù)后判斷提供重要的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

PLGA (丙交酯：乙交酯為75∶25，分子量為8000 Da，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司)、油酸修飾的Fe3O4(10 nm，25 mg/mL，美國(guó)大洋科技有限公司)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，分子量為30000～70000 Da，美國(guó)Sigma公司)、殼聚糖(chitosan，CS，分子量為50000 Da，上海麥金林生化有限公司)、DS (分子量為5000 Da，上海阿拉丁試劑有限公司)、DiI和DAPI染色劑(美國(guó)Sigma公司)、CCK8檢測(cè)試劑盒(日本同仁)，所有試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

超聲振蕩儀(VCY-500，YYSonics有限公司，中國(guó)上海)、動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)器(Malvern Instruments，馬爾文有限公司)、透射電鏡(日立7500，日立公司)、光學(xué)顯微鏡(Leica DMI8，Leica有限公司)、流式細(xì)胞儀(FACSVantage，美國(guó))、1.5 T MRI掃描儀(HDXT2012，GE Medical Systems，美國(guó))、光聲成像儀(Vevo Laser，VisualSonics，加拿大)、激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1，日本)、酶標(biāo)儀(Synergy HT，BioTek Instruments，美國(guó))。

1.2 雙模態(tài)納米粒的制備及表征

1.2.1 非靶向納米粒的制備

采用雙乳化法，首先將50 mg PLGA加入到2 mL二氯甲烷中，制備DiI染色納米粒時(shí)在此過(guò)程中加入少量DiI，待其完全溶解后滴加100 μL油酸修飾的Fe3O4，輕微搖晃至完全混合。加入200 μL的雙蒸水作為內(nèi)水相，在常溫條件下用聲振儀聲振3 min，功率為130 W×40%，產(chǎn)生咖色初乳液。接著加入6 mL 4%的PVA溶液作為外水相，聲振儀聲振5 min，形成棕色復(fù)乳液。然后加入10 mL 2%的異丙醇，將上述溶液在冰浴條件下置于通風(fēng)櫥連續(xù)攪拌3 h，使得有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，非靶向納米粒(PLGA-Fe3O4)表面固化。最后經(jīng)雙蒸水離心洗滌3次除去上清液，將收集的納米粒置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 靶向納米粒的制備

在上述制備過(guò)程中，將6 mL 4%的PVA溶液替換為3 mL 4%的PVA溶液和3 mL 2%的CS溶液(溶解于3%的乙酸)混合液，除去上清液后，用雙蒸水將納米粒重懸至5 mL，然后加入10 mg DS，冰浴搖床1 h通過(guò)靜電吸附作用制備PLGA-Fe3O4-DS納米粒，離心洗滌后稀釋至10 mg/mL并置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 納米粒的理化性質(zhì)

用動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)器測(cè)定PLGA-Fe3O4-DS納米粒的平均粒徑、表面電位和多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)，使用透射電鏡分析其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，用光學(xué)顯微鏡連續(xù)一周觀察其分布及形態(tài)特征，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DS的連接率。

1.3 納米粒磁共振成像及光聲成像研究

1.3.1 納米粒磁共振成像

將PLGA-Fe3O4-DS納米粒與1%的瓊脂溶液混合，產(chǎn)生濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的納米粒后，轉(zhuǎn)至5 mL Eppendorf管中，將其依次置于充滿水的塑料容器中，以減少空氣偽影。使用1.5 T磁共振掃描儀進(jìn)行T2*WI掃描，采用頭顱專用單通道正交線圈，梯度回波序列(gradient echo sequence，GRE)。掃描參數(shù)為：回波時(shí)間(echo time，TE)=10.7 ms，重復(fù)時(shí)間(repetition time，TR)=520 ms，掃描層厚=3 mm，掃描視野(field of view，F(xiàn)OV)=180 mm，翻轉(zhuǎn)角(flip angle，F(xiàn)A)=45°。

1.3.2 納米粒光聲成像

依次將100 μL濃度為 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的PLGA-Fe3O4-DS納米粒加入到帶孔的凝膠模型中，用波長(zhǎng)為706 nm的激光輻照60 s后，以光聲成像系統(tǒng)采集納米粒的光聲圖。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 納米粒對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向性

體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，用100 ng/mL脂多糖對(duì)其進(jìn)行活化24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2.0×105/孔接種于直徑為15 mm培養(yǎng)皿中24 h后，用0.5 mg/mL的DiI標(biāo)記的PLGA-Fe3O4或PLGA-Fe3O4-DS納米粒培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，用4%的多聚甲醛在室溫下固定15 min，再次洗滌細(xì)胞并用DAPI將細(xì)胞核染色10 min，洗掉多余的染料，放置于激光共聚焦顯微鏡上對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行觀察并采集圖像。

1.4.2 納米粒的細(xì)胞毒性

將活化的RAW 264.7以1×104/孔接種于96孔板中，孵育24 h，用濃度0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL的PLGA-Fe3O4-DS納米粒培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱后孵育24 h，然后用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入10μL的CCK8溶液后繼續(xù)孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量溶液的吸光度，分別計(jì)算每個(gè)孔中細(xì)胞的存活率。

2 結(jié)果

2.1 納米粒的理化特征

制備的PLGA-Fe3O4-DS納米粒經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)器測(cè)得平均粒徑為(263.93±21.38 nm (圖1A)，表面電位為(-20.63±2.61) mV (圖1B)，PDI為0.099±0.068。透射電鏡下觀察納米粒大小約260 nm，油酸修飾的Fe3O4分布在納米粒的殼上，納米粒外膜可見DS的透明結(jié)構(gòu)(圖1C)。在光鏡下納米粒形態(tài)規(guī)則呈球形，大小均勻，分散性好(圖1D)，連續(xù)一周內(nèi)觀察該納米粒大小形態(tài)無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比，PLGA-Fe3O4-DS納米粒外殼波長(zhǎng)發(fā)生了改變，流式細(xì)胞儀測(cè)得含有DS的納米粒其連接率為90.06%(圖2)。

2.2 納米粒的多模態(tài)成像

2.2.1 納米粒磁共振成像

磁共振掃描圖顯示，PLGA-Fe3O4-DS納米粒可有效降低T2*信號(hào)，隨著樣品中納米粒濃度的增加，T2*信號(hào)強(qiáng)度降低越明顯(圖3A)。

2.2.2 納米粒光聲成像

在激光照射下，與無(wú)光聲信號(hào)的水溶液相比，不同濃度的PLGA-Fe3O4-DS納米粒均顯示出紅色的光聲信號(hào)，并且隨著濃度的遞增，光聲信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖3B)。

2.3 納米粒的體外靶向性

激光共聚焦顯微鏡下可以看到，納米粒與活化的RAW 264.7共孵育2 h后，DiI標(biāo)記的PLGA-Fe3O4-DS帶紅色熒光納米粒聚集在細(xì)胞核周邊，而在非靶向組中未觀察到DiI標(biāo)記的PLGA-Fe3O4納米粒在細(xì)胞周圍聚集(圖4)。

2.4 納米粒的細(xì)胞毒性

將RAW 264.7細(xì)胞與不同濃度的PLGA-Fe3O4-DS納米粒共孵育24 h后，在濃度為8 mg/mL以下時(shí)細(xì)胞存活率均在85%以上(圖5)。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的細(xì)胞及組織成分多樣，在納米粒的制備過(guò)程中，原材料之間的相互作用及復(fù)雜繁瑣的制備步驟會(huì)在一定程度上影響納米粒對(duì)斑塊的診斷效能。因此，本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上用改良的雙乳化法和靜電吸附法制備PLGA-Fe3O4-DS納米粒[5-7]，該制作步驟簡(jiǎn)便可操作性強(qiáng)，且制備的納米粒大小均一、分散性好，在連續(xù)一周內(nèi)觀察無(wú)明顯大小形態(tài)變化，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。得到的納米粒平均粒徑為(263.93±21.38) nm，可減少被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲[8]，縮短了在血液循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間，能夠充分聚集于動(dòng)脈粥樣硬化病變處，更好地對(duì)疾病進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者基于不同的影像技術(shù)制備了靶向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的各種分子探針[9-10]，單一模式的成像技術(shù)對(duì)病變的顯示有自身的局限性，存在一定的偏差，而多模態(tài)成像運(yùn)用兩種或兩種以上的成像模式，使各種成像技術(shù)能夠優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提供更加全面的相關(guān)組織和疾病病理生理學(xué)信息。磁共振成像技術(shù)具有軟組織分辨率高、多方位、多參數(shù)成像的特點(diǎn)，能夠進(jìn)行深部及小血管檢測(cè)[11]，但噪音大、時(shí)間分辨率低。光聲成像技術(shù)利用組織光能量的吸收分布推測(cè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新興的一種成像技術(shù)，結(jié)合了純光學(xué)與純聲學(xué)顯像空間分辨率高、對(duì)比度好等優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)深部組織的穿透力不如磁共振[12]。Fe3O4可用作磁共振顯像劑[13]，同時(shí)作為“光吸收子”，也可用于光聲成像。在本研究中，磁共振掃描結(jié)果顯示不同濃度的PLGA-Fe3O4-DS納米粒均能降低T2*信號(hào)，且隨著樣品中納米粒濃度的增加，T2*信號(hào)強(qiáng)度降低越明顯，油酸修飾的Fe3O4嵌于納米粒殼上，不會(huì)發(fā)生明顯的突釋現(xiàn)象，穩(wěn)定性優(yōu)良，該納米粒能夠有效降低T2*信號(hào)，具有良好的磁共振負(fù)性增強(qiáng)效果。在體外光聲成像中，納米粒在激光照射下能將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為可觀測(cè)的聲信號(hào)，隨著納米粒濃度遞增，光聲信號(hào)逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明納米粒具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性，能夠很好地進(jìn)行光聲成影。因此，本研究制備的PLGA-Fe3O4-DS納米粒能夠結(jié)合磁共振成像及光聲成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，期望從分子水平對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊實(shí)現(xiàn)更全面的影像學(xué)分析。

動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的細(xì)胞成分中巨噬細(xì)胞的含量是最為豐富的，病變的早期特征性病理變化便是巨噬細(xì)胞的活化，活化的細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)SR-A[14-15]，本研究選擇活化巨噬細(xì)胞中的SR-A作為靶點(diǎn)。硫酸葡聚糖是巨噬細(xì)胞表面SR-A的配體之一，生物相容性、生物降解性良好，可降低患者血液中低密度脂蛋白的含量，具有逆轉(zhuǎn)和穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的潛能[16]。在細(xì)胞靶向?qū)嶒?yàn)中，納米粒與活化的RAW264.7細(xì)胞共孵育2 h后，在靶向組中可以觀察到大量帶紅色熒光的PLGAFe3O4-DS聚集在細(xì)胞核周圍，非靶向組中PLGA-Fe3O4納米粒不含配體DS，對(duì)細(xì)胞沒有親和力，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被PBS洗掉后幾乎觀察不到紅色熒光，表明PLGAFe3O4-DS納米粒在靶向受體作用介導(dǎo)下可被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞，這種靶向作用可以在一定程度上抵抗動(dòng)脈血流的剪切力，使納米粒與巨噬細(xì)胞結(jié)合以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)成像及治療潛能。此外，細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，將細(xì)胞置于各種濃度納米粒24 h后，細(xì)胞增殖沒有受到阻礙，細(xì)胞存活率都大于85%，表明納米粒的細(xì)胞毒性作用甚低，有很好的生物安全性。

綜上所述，本研究制備的PLGA-Fe3O4-DS納米粒具備良好的磁共振成像和光聲成像能力，對(duì)活化RAW264.7細(xì)胞的SR-A有較高的親和力，有望在分子水平分析SR-A在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過(guò)程中的規(guī)律，為易損斑塊的準(zhǔn)確診斷、無(wú)創(chuàng)性治療及活體動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)其療效提供新的思路。

利益沖突：無(wú)。