李 政，何松哲，洪 鑄，趙 麗，楊 秋

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541001)

肺炎克雷伯菌是條件致病菌，常引起醫(yī)院感染。1986年中國臺(tái)灣首次報(bào)道了肺炎克雷伯菌感染導(dǎo)致肝膿腫合并感染性眼內(nèi)炎[1]，引起了臨床的廣泛關(guān)注。進(jìn)一步研究表明其毒力明顯高于經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella Pneumonia，cKP)，其不僅能引起醫(yī)院獲得性感染，亦能導(dǎo)致年輕健康個(gè)體致病，并且發(fā)病率和病死率非常高[2]，感染后常常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，如眼內(nèi)炎、腦膜炎和壞死性筋膜炎[3]。

近年來，歐洲、美洲、澳洲等許多國家對(duì)高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella Pneumonia，hvKP)方面的研究報(bào)道較多，而國內(nèi)的報(bào)道相對(duì)較少。筆者探究肺炎克雷伯菌血流感染患者的臨床及菌株的特征，為臨床預(yù)防及控制hvKP感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集 2019年1月至2019年12月從患者血培養(yǎng)分離出來的肺炎克雷伯菌，剔除重復(fù)菌株。依據(jù)患者的病案號(hào)查詢并收集其年齡、性別、基礎(chǔ)疾病以及侵入性操作等資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者出現(xiàn)臨床感染癥狀并且血培養(yǎng)分離出肺炎克雷伯菌。當(dāng)患者在入院48 h內(nèi)血培養(yǎng)出肺炎克雷伯菌時(shí)定義為社區(qū)獲得性感染，而患者的血流肺炎克雷伯菌感染發(fā)生在入院后48 h以上或患者接受過侵入性治療時(shí)定義為院內(nèi)獲得性感染。

1.2 儀器與試劑

BacT/Alert 3D血培養(yǎng)儀(美國 BioMerieux.INC)，VITEK 2Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)系統(tǒng)(美國 BioMerieux.INC)，全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)VITEK MS(法國BioMerieux.SA)，PCR儀(美國ABI公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(上海Bioshine公司)，DNA提取試劑盒(天根生物試劑有限公司)，PCR試劑及DNA marker購買于南京諾唯贊公司，相關(guān)擴(kuò)增引物由上海生工合成。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 菌株鑒定與藥物敏感試驗(yàn) 細(xì)菌鑒定方法采用全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)VITEK MS，藥物敏感試驗(yàn)采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)檢測(cè)，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯菌ATCC700603，均購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。亞胺培南和美羅培南MIC值采用紙片法進(jìn)一步確認(rèn)，解釋標(biāo)準(zhǔn)參照2018版美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 拉絲試驗(yàn) 用細(xì)菌接種環(huán)挑取血平板過夜培養(yǎng)的菌落，如挑起黏液絲長度≥5 mm，則判為拉絲試驗(yàn)陽性；如不能挑起黏液絲或黏液絲長度<5 mm判為陰性[4]。

1.3.3 DNA提取及多位點(diǎn)序列分析(MLST) 用DNA提取試劑盒提取菌株DNA，根據(jù)肺炎克雷伯菌的DNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增7對(duì)管家基因(rpoB、gapA、mdh、Pgi、phoE、infB、tonB)，隨后進(jìn)行測(cè)序并分析。根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫確定等位基因及ST型(www.pasteur.fr/mlst/Kpneumonia.html)。

1.3.4 莢膜血清型和rmp A基因檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]合成引物，檢測(cè)常見莢膜型K1、K2、K5、K20、K54、K57和rmp A基因。引物序列見表1。

表1 莢膜表型相關(guān)基因和rmpA基因的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.6軟件分析藥敏結(jié)果，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。高毒力和經(jīng)典肺炎克雷伯菌藥物敏感率比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高毒力肺炎克雷伯菌的檢出率

130株肺炎克雷伯菌中，拉絲試驗(yàn)陽性的高毒力肺炎克雷伯菌占29.23%(38/130)。

2.2 多位點(diǎn)序列分析(MLST)分型

MLST分型主要的流行株是ST23(30/130，23.08%)，其次為ST11(18/130，13.85%)、ST15(8/130，6.15%)、ST65(8/130，6.15%)，這4種ST型共占分離株的49.23%(64/130)。ST分型與不同血清型呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。K1血清型主要以ST23型為主，K2血清型主要以ST65型為主。

2.3 血清型與rmpA基因的關(guān)系

拉絲試驗(yàn)陽性的菌株rmpA基因檢測(cè)均為陽性，但有12株rmpA陽性的菌株拉絲試驗(yàn)是陰性。其中2株rmpA和拉絲試驗(yàn)陽性的菌株不屬于目標(biāo)檢測(cè)的高毒力株血清型K1、K2、K5、K20、K54和K57型。在hvKP菌株中，高毒力莢膜血清型檢出率為94.7%(36/38)，分別為 Kl型26株占68.4%、K2型4株占10.5%、K57型4株占10.5%和K20型2株占5.3%。其他2株不屬于所檢測(cè)的6個(gè)型別中的任何一型，未檢出K5、K54血清型。見表2。

表2 130株肺炎克雷伯菌的分子生物特性

2.4 臨床分布

130株肺炎克雷伯菌中，38(29.2%)株為hvKP，92(70.8%)株為cKP；38例 hvKP感染患者中，30例為醫(yī)院獲得性感染，8例為社區(qū)獲得性感染，醫(yī)院感染中常伴有多種基礎(chǔ)疾病和誘發(fā)因素，基礎(chǔ)疾病中以肝膽疾病為多發(fā)，誘發(fā)因素中以外科手術(shù)等侵襲性操作為主，38例hvKP感染患者中有33例好轉(zhuǎn)出院，有3例(7.89%)死于感染性休克造成的多臟器衰竭。見表3。

表3 130株肺炎克雷伯菌的分布

2.5 抗生素敏感性試驗(yàn)

高毒力肺炎克雷伯菌對(duì)試驗(yàn)藥物敏感性明顯高于經(jīng)典肺炎克雷伯菌，41.54%(54/130)分離株產(chǎn)ESBLs。其中經(jīng)典肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs的比例是53.26%(49/92)，而高毒力肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs的比例是13.16%(5/38)(χ2=17.809，P<0.01)。見表4。

表4 hvKP與cKP對(duì)藥物敏感性分析

3 討論

高毒力肺炎克雷伯菌引起的感染性疾病主要出現(xiàn)在亞洲人群中[7]，可能與宿主的易感性和地域病原體暴露水平有關(guān)。筆者的研究中高毒力肺炎克雷伯菌檢出38株，檢出率29.2%。

肺炎克雷伯菌的莢膜是主要的毒力因子，可以抵抗或者逃避宿主的免疫殺傷作用。根據(jù)莢膜多糖(K抗原)分型，可將肺炎克雷伯菌分為78個(gè)K血清型，一些血清型包括：K1、K2、K5、K20、K54和K57被認(rèn)為是與高毒力肺炎克雷伯菌相關(guān)，其中，K1和K2莢膜血清型與hvKP密切相關(guān)[8-9]。本研究共檢出K1、K2、K20和K57等4種高毒力的血清型，沒有檢測(cè)到K5或K54，與黎斌斌[10]的報(bào)道基本一致。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)K1血清型不僅與社區(qū)獲得性肝膿腫密切相關(guān)，同時(shí)亦與原發(fā)菌血癥相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，免疫正常的患者中高毒力株肺炎克雷伯菌可引起嚴(yán)重感染，有的肝膿腫患者沒有任何基礎(chǔ)疾病。

本研究中4位60歲以下無任何基礎(chǔ)疾病的男性肝膿腫患者，其菌株均為ST23K1血清型，推測(cè)可能是克隆相關(guān)感染。魏丹丹[11]研究表明，hvKP的MLST分型多為ST23，而產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(carbapenemase resistant Klebsiella pneumonia，CRKP)多為ST11型。本研究中38例hvKP的MLST分型中，ST23占26例，雖檢出1例ST11，但其耐藥表型未發(fā)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯酶耐藥，可能原因是該菌株產(chǎn)酶量低或者非產(chǎn)酶株。

高毒力肺炎克雷伯菌所致感染包括腹部疾病(社區(qū)獲得性肝膿腫、脾膿腫、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎)、眼內(nèi)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(腦膜炎)、胸部疾病(肺炎、膿胸)、骨骼肌與軟組織感染、尿道感染、混合感染、菌血癥，其中最常見的是社區(qū)獲得性肝膿腫。本研究顯示，21.1%(8/38)高毒力肺炎克雷菌感染的患者其原發(fā)灶來自肝膿腫，患有肝臟相關(guān)基礎(chǔ)疾病的患者是高毒力肺炎克雷伯菌的主要危險(xiǎn)因素。但近年來，由產(chǎn)碳青霉烯酶高毒力肺炎克雷伯菌(carbap-enemase producing hypervirulent Klebsiella pneumonia，CP-hvKP)引起醫(yī)院感染的散發(fā)或者聚集性案例逐漸增多[12]。因此，對(duì)于此類細(xì)菌引起的感染應(yīng)當(dāng)引起醫(yī)護(hù)人員足夠的重視。

肺炎克雷伯菌血流感染時(shí)，易隨血流播散至其他部位形成感染，若為高黏液表型的菌株，由于毒力強(qiáng)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的侵襲性感染，如眼內(nèi)炎，腦膜炎等。因此，為了及早引起臨床醫(yī)師的關(guān)注，加強(qiáng)對(duì)患者的治療，控制嚴(yán)重侵襲性感染的發(fā)生，建議臨床微生物實(shí)驗(yàn)室不僅要開展肺炎克雷伯菌藥物敏感性檢測(cè)，還有必要檢測(cè)肺炎克雷伯菌的黏液性狀表型、血清莢膜型和毒力基因，并及時(shí)將檢測(cè)結(jié)果與臨床溝通。

目前，世界范圍內(nèi)高毒力肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素耐藥還非常罕見(除了對(duì)氨芐西林天然耐藥)，本研究中高毒力肺炎克雷伯菌對(duì)藥物敏感性明顯高于經(jīng)典肺炎克雷伯菌，但也發(fā)現(xiàn)了5株產(chǎn)ESBLs高毒力肺炎克雷伯菌。多藥耐藥的肺炎克雷伯菌感染成為抗感染治療的嚴(yán)重問題，產(chǎn)碳青烯酶(KPC)菌株也在逐年增加。高毒力肺炎克雷伯菌通過質(zhì)粒獲取耐藥基因后可能成為高毒力高耐藥菌，應(yīng)引起臨床高度重視。