黎超蓮，農(nóng)海斌，盧昱超，彭園園，周英瓊，徐龍寬

(1.桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541001)

鼻咽癌是我國南方省份及東南亞高發(fā)的一種惡性腫瘤，有明顯的種族聚集性和地域性,每年的發(fā)病率15～50/100 000人[1]。有研究表明，鼻咽癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多途徑、多機(jī)制的過程。各種環(huán)境因素、EBV感染、遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致癌基因過表達(dá)及抑癌基因表達(dá)下調(diào)或缺失，經(jīng)過癌前病變，最終發(fā)展成鼻咽癌[2]。目前放療或放化療同步是其主要治療手段，治療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因，5年生存率45%左右。放療的多藥耐藥性影響了鼻咽癌患者的放療效果和生存質(zhì)量[3]。近幾年，基因靶向治療在腫瘤學(xué)上關(guān)注度很高，因此，發(fā)現(xiàn)特異性的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床早期診斷、干預(yù)以及治療具有重要意義。Yes激酶相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)、轉(zhuǎn)錄聯(lián)合激活因子(The transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)是Hippo信號(hào)通路的重要成員，主要參與調(diào)節(jié)器官的發(fā)育，并且與腫瘤的形成有關(guān)[4]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，YAP、TAZ表達(dá)水平的升高或核移位，可見于人類各種系統(tǒng)腫瘤，較為常見的有乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、胃癌[7]等，且敲低YAP、TAZ的表達(dá)可以阻止腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步轉(zhuǎn)移，甚至改善預(yù)后。YAP、TAZ的表達(dá)水平在某些惡性腫瘤中可以作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一[8]，且Hippo信號(hào)通路可能影響腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，臨床上可通過干預(yù)該通路以提高腫瘤的治療效果，提高患者的生存率[9]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信號(hào)通路中的重要成員，β-catenin作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，兼有胞間連接和信號(hào)傳導(dǎo)的功能[10]。筆者闡述了YAP、TAZ、β-catenin三者在鼻咽癌中的作用及其相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2009年1月至2013年12月存檔的100例鼻咽癌組織蠟塊作為實(shí)驗(yàn)組，另取同期非腫瘤鼻咽黏膜組織30例作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前沒有經(jīng)過臨床的化學(xué)治療以及生物治療，且臨床及病理資料完整。100例鼻咽癌患者年齡13～75(47.5±13.2)歲，其中<50歲56例，≥50歲44例，根據(jù)TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期86例，Ⅲ～Ⅳ期14例。病理分型：非角化性未分化型癌92例，非角化性分化型癌8例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及試劑

本實(shí)驗(yàn)所納入的組織標(biāo)本均使用以下方法處理：①10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。②4.0 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水后，EDTA(pH 8.0)高壓修復(fù)抗原；PBS沖洗。③PBS沖洗3次，3 min/次，后用H2O2浸泡10 min；PBS沖洗3次，3 min/次；滴加羊血清(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，稀釋倍數(shù) 1∶10)，置于37 ℃溫箱中封閉30 min。④滴加一抗，PBS沖洗3次，3 min/次，后滴加二抗，室溫放置15 min。⑤PBS沖洗3次，3 min/次，然后用DAB(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)顯色。⑥蘇木精復(fù)染。⑦中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以陽性表達(dá)的乳腺癌組織為陽性對(duì)照。鼠源性YAP單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，稀釋濃度為1∶200；兔源性TAZ多克隆抗體購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司，稀釋濃度為1∶1 000；兔源性β-catenin多克隆抗體購自武漢博士德生物公司，稀釋濃度為1∶200；即用型免疫組化Eli Vision TMsuper試劑盒(鼠/兔)和免疫組化一抗稀釋液均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 判斷方法與標(biāo)準(zhǔn)

每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞。判斷標(biāo)準(zhǔn)：①按陽性著色程度評(píng)分：0分為無著色，與背景色一致；1分為稍淺黃色，比背景顏色略深；2分為棕黃色，明顯比背景色深；3分為棕褐色。②按陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：0分為陰性；1分為10%以下；2分為11%～50%；3分為51%～75%；4分為75%以上。每張切片以兩者乘積判定陽性結(jié)果：0～2分為陰性(-)；3～4分為弱陽性(+)；5～8分為中度陽性(++)；9～12分為強(qiáng)陽性結(jié)果(+++)，將≥3分定為陽性結(jié)果，<3分定為陰性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用%表示，差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)YAP、TAZ之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 YAP、TAZ、β-catenin在不同組織中的表達(dá)

YAP、TAZ以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，β-catenin在非腫瘤鼻咽黏膜組織中主要以細(xì)胞膜著色為主，而在鼻咽癌組織中除了細(xì)胞膜著色還出現(xiàn)細(xì)胞漿的異位表達(dá)(見圖1)。實(shí)驗(yàn)組100例鼻咽癌組織中，YAP、TAZ、β-catenin的陽性例數(shù)、陽性表達(dá)率分別為91(91.0%)、64(64.0%)、81(81.0%)。30例非腫瘤鼻咽黏膜組織中，YAP、TAZ、β-catenin的陽性例數(shù)、陽性表達(dá)率分別為10(33.3%)、1(3.3%)、12(40.0%)。YAP、TAZ在鼻咽癌組織的陽性表達(dá)率顯著高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌組織中的異位表達(dá)率明顯高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)。詳見表1。

表1 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織、非腫瘤鼻咽黏膜組織中表達(dá)(n，%)

A、B：YAP在非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中的表達(dá)；C、D：TAZ在非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中的表達(dá)；E、F：β-catenin在非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中的表達(dá)

圖1 非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中YAP、TAZ、β-catenin的表達(dá)(SP×200)

2.2 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

YAP、TAZ在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率與鼻咽癌的病理分型有關(guān)(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌組織中的異位表達(dá)率與鼻咽癌的病理分型有關(guān)(P<0.05)；TAZ在鼻咽癌中的陽性表達(dá)率與性別、5年生存率有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著關(guān)系(P>0.05)；YAP、β-catenin在鼻咽癌中的異常表達(dá)率與性別、年齡、臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、5年生存率無顯著關(guān)系(P>0.05)。詳見表2。

表2 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(n)

2.3 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達(dá)相關(guān)性分析

在91例YAP陽性表達(dá)組中，YAP、TAZ共陽性表達(dá)61例，在9例 YAP陰性表達(dá)組中，YAP、TAZ共陰性表達(dá)6例，χ2檢驗(yàn)提示在鼻咽癌組織中，YAP與TAZ蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)成正相關(guān)(P=0.045)；YAP、TAZ表達(dá)與β-catenin蛋白異位表達(dá)成正相關(guān)(P<0.05)。詳見表3。

表3 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性分析

3 討論

在哺乳動(dòng)物中YAP和TAZ是Hippo通路的下游效應(yīng)分子，YAP基因定位于人類染色體11q22，在正常生理狀態(tài)下廣泛表達(dá)于機(jī)體組織中。TAZ也被稱為WWTR1，TAZ與YAP同源，兩者之間有46%氨基酸序列是相同的[11]。Hippo信號(hào)通路調(diào)控腫瘤發(fā)生，YAP、TAZ高表達(dá)廣泛出現(xiàn)于多種惡性腫瘤中，YAP、TAZ被看作是致癌因子，針對(duì)腫瘤中的YAP、TAZ，目前研究YAP、TAZ抑制劑已成為一種必然的趨勢，Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)在肝星狀細(xì)胞中，異甘草酸鎂能通過抑制Hippo通路以達(dá)到控制炎癥的作用。楊生輝等[13]通過Western blot、免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法檢測科羅索酸對(duì)肺癌細(xì)胞株A549中YAP蛋白定量和定位的影響，結(jié)果顯示科羅索酸能明顯抑制肺癌細(xì)胞株A549中YAP蛋白的表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。開發(fā)更加高效特異的YAP、TAZ 抑制劑將對(duì)腫瘤的臨床治療提供極大的幫助。

近些年來，對(duì)Hippo通路促進(jìn)腫瘤形成的發(fā)生機(jī)制的研究越來越多，YAP、TAZ是如何促進(jìn)腫瘤的形成？綜合國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中Hippo通路和Wnt/β-catenin通路有密切聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)腫瘤的形成。眾多研究表明Wnt/β-catenin是致癌通路，當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常活化時(shí)會(huì)促使腫瘤發(fā)生[14]。有研究表明，Hippo通路和Wnt/β-catenin通路在不同的細(xì)胞中有不同的相互作用，在心肌細(xì)胞中，YAP與β-catenin相互促進(jìn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以控制心臟大小、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與穩(wěn)定；而在肝細(xì)胞癌中，Wnt/β-catenin通過抑制YAP、TAZ的活性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[15]。溫宗華等[16]研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin、Survivin在鼻咽癌組織中存在異常表達(dá)，且兩者在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起到協(xié)同促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) β-catenin在鼻咽癌組織中存在細(xì)胞漿異常表達(dá)，且YAP、TAZ與β-catenin蛋白異位表達(dá)成正相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，YAP、TAZ在鼻咽癌組織的陽性表達(dá)率顯著高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌組織中的異位表達(dá)率明顯高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)，且YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的異常表達(dá)率與鼻咽癌的病理分型有關(guān)(均P<0.05)。8例非角化性分化型癌組織中YAP、TAZ、β-catenin的陽性表達(dá)率分別為62.5%、25.0%、37.5%，而92例非角化性未分化型癌組織中YAP、TAZ、β-catenin的陽性表達(dá)率分別為93.5%、67.4%、84.8%(均P<0.05)，提示YAP、TAZ、β-catenin可能與鼻咽癌的病理分化過程、發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，這三者在鼻咽癌組織中的異常表達(dá)可能導(dǎo)致鼻咽部腫瘤的形成。但由于非角化性分化型癌例數(shù)較少，YAP、TAZ、β-catenin的異常表達(dá)率與鼻咽癌病理分型呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。TAZ在鼻咽癌中的陽性表達(dá)率與5年生存率有關(guān)(P<0.05)，提示TAZ蛋白的異常表達(dá)與鼻咽癌患者的預(yù)后有關(guān)，但具體相關(guān)性有待進(jìn)一步行蛋白定量研究。

通過對(duì)YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽部組織中的研究，結(jié)果提示YAP、TAZ高表達(dá)、β-catenin異位表達(dá)在鼻咽癌中起致癌作用，給我們提供一個(gè)思路，是否可以通過抑制YAP、TAZ蛋白的表達(dá)水平、抑制β-catenin的異位表達(dá)，用于預(yù)防腫瘤的形成、抑制癌組織進(jìn)一步惡化，或通過檢測YAP、TAZ、β-catenin的表達(dá)水平以達(dá)到鼻咽癌早期篩查、治療及評(píng)估預(yù)后的作用。這為鼻咽癌的臨床診斷和治療、為開發(fā)YAP、TAZ抑制劑提供了可供參考的理論基礎(chǔ)，為鼻咽癌基因靶向治療藥物開發(fā)提供參考的理論依據(jù)。