駱麗如，曾澤南，謝文杰，胡璐曼，唐忠海

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

桑樹枝葉的藥用功效在《本草綱目》已有較多記載[1-2]，且我國已將桑樹枝葉作為治療消渴癥（糖尿?。┑闹兴幹唬瑧?yīng)用于臨床[3]。上個(gè)世紀(jì)80年代，日本科學(xué)家指出，桑樹枝葉中的1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是治療糖尿病的有效物質(zhì)[4-5]。DNJ的化學(xué)結(jié)構(gòu)[6]與葡萄糖相似，是桑樹枝葉中的一種哌啶生物堿[7-8]。在自然界中，桑樹枝葉中DNJ含量最高[9]。周炎等[10]通過灌胃等量桑枝水提液、二倍量桑枝水提液、鹽酸二甲雙胍片，高血糖小白鼠的血糖值4周后分別下降了7.63%、15.72%、18.41%，綜合相關(guān)研究表明，桑葉枝葉中豐富的DNJ是α-葡萄糖苷酶的一種抑制劑[11]，具有降低血糖[12-15]、抑制病毒活性和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等作用[16-18]。

微波提取法、超聲波輔助提取法和超臨界萃取技術(shù)[19-20]等作為新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于DNJ的提取，其中胡瑞君等[21]利用微波萃取技術(shù)提取桑葉中DNJ，確定最佳提取工藝條件為：微波功率406 W，微波處理時(shí)間1.5 min，固液比 1 ∶40（g/mL），提取次數(shù) 2 次，DNJ提取率為0.024%?；←惖萚22]通過超聲波輔助提取法確定了提取DNJ的最佳條件為：超聲功率125 W，每克桑葉浸提劑用量40 mL，超聲溫度70℃，超聲時(shí)間20 min，DNJ的得率為0.091%。由于DNJ分子在紫外、可見光波段內(nèi)無吸收峰，因此常規(guī)的分光光度法無法檢測(cè)其存在和含量[23]，而常采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[24-25]、柱前衍生化高效液相色譜法[26-27]、氣相法[28]等方法檢測(cè)DNJ。

研究與開發(fā)內(nèi)生真菌已成為解決某些植物藥藥源危機(jī)的最佳途徑之一[29]?，F(xiàn)已證明，內(nèi)生真菌能夠參與植物活性成分的合成或?qū)χ参锏拇渭?jí)代謝產(chǎn)物有轉(zhuǎn)化作用[30]。同時(shí)，桑樹內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性[31]且能產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)[32]。本試驗(yàn)通過分離桑樹中內(nèi)生真菌及其發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)并鑒定內(nèi)生真菌，通過FMOCCl柱前衍生化高效液相色譜法對(duì)其產(chǎn)生的DNJ進(jìn)行分析，初步認(rèn)為有望利用該菌株提高DNJ的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑樹健康枝條采摘于瀏陽河畔（系統(tǒng)隨機(jī)抽樣）：桑葉粉末由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；土豆：市售。

1.2 主要儀器設(shè)備

CR21G高速冷凍智能離心機(jī)：日本日立公司；SWCJ-1B單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋、GRX20干熱消毒箱、SYC-L1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TOMY SS-325濕熱滅菌鍋：Tomy KOGYO有限公司；AL204電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；PHB-1筆型pH計(jì)：上海宇龍儀器有限公司；PYX-250Z-A振蕩培養(yǎng)箱：廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；1200Series高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；BCD-216ZDJ海爾冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 試劑

DNJ（純度 99%）：Sigma公司；芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）（純度 98%）：上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司；95%酒精、葡萄糖（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四硼酸鈉（分析純）：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；瓊脂粉末：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；100萬單位注射用硫酸鏈霉素：華北制藥股份有限公司；甲醇（色譜純）：SK化工；冰乙酸（分析純）：天津市博迪化工有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

分離與保藏培養(yǎng)基：土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂1.8%～2.0%，自然pH，121℃滅菌25 min，滅菌后加入100 μg/mL硫酸鏈霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20%土豆、2%葡萄糖。自然pH，121℃滅菌25 min。

1.5 方法

1.5.1 內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)和鑒定

參照梁嘉俊的方法[33]分離桑樹產(chǎn)生的內(nèi)生真菌。用自來水沖洗直徑約0.5 cm的新鮮健康桑樹枝條，晾干后將其切成長度約1.5 cm數(shù)小段。在超凈工作臺(tái)上，依照下列過程按無菌操作方法對(duì)其進(jìn)行表面滅菌：首先用75%的酒精漂洗3 min～5 min，無菌水沖洗3次～4次，再用0.1%升汞漂洗15 min，最后用無菌水沖洗5次。將已滅菌處理的桑樹枝條在已滅菌的培養(yǎng)皿中沿枝條縱向切成兩半（直徑0.5 cm左右、長度為1.5 cm左右的半圓柱形），用已滅菌的鑷子將其接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基平板上（將縱切面接觸培養(yǎng)基），然后將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察并檢查是否有雜菌污染；待與培養(yǎng)基接觸的縱切面邊緣有菌絲體長出，將菌絲體轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離純化；經(jīng)過多次分離純化，將菌絲體接種于試管斜面，保存?zhèn)溆谩?/p>

依照絲狀真菌的鑒定方法，根據(jù)菌落和孢子形態(tài)對(duì)菌絲體進(jìn)行初步鑒定；然后將菌種寄到北京三博遠(yuǎn)志公司對(duì)菌絲體進(jìn)行精確鑒定。

為了確定桑樹枝條表面滅菌的徹底性以及超凈工作臺(tái)內(nèi)空氣的潔凈度，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一個(gè)內(nèi)生真菌培養(yǎng)的對(duì)照組和空白組。對(duì)照組：直接將滅菌處理的桑樹枝條接種在PDA培養(yǎng)基平板上，再置于相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)；空白組：將PDA培養(yǎng)基平板蓋揭開并將PDA培養(yǎng)基平板暴露在空氣中一段時(shí)間后，再采用相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)。如果對(duì)照組的桑樹枝條周圍無任何菌絲體長出，空白組培養(yǎng)基上無菌落長出，則說明超凈工作臺(tái)內(nèi)空氣潔凈度較高，桑樹枝條表面滅菌徹底，所分離到的菌是桑樹枝條內(nèi)生菌，而不是桑樹枝條表面的附生菌。

1.5.2 菌種發(fā)酵試驗(yàn)

參照何佳等的方法[34]分離桑樹產(chǎn)生的內(nèi)生真菌。菌種發(fā)酵試驗(yàn)分為3組：試驗(yàn)組、對(duì)照組以及空白組。試驗(yàn)組：共兩組，一組將不加入桑葉粉末的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌后，接種已鑒定菌種進(jìn)行搖瓶液體發(fā)酵；另一組將按料液比1∶30（g/mL）加入桑葉粉末的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌后，接種已鑒定菌種進(jìn)行搖瓶液體發(fā)酵；兩組培養(yǎng)溫度均為28℃，發(fā)酵周期為7 d。對(duì)照組：將按料液比1∶30（g/mL）加入桑葉粉末PDA培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌后不接種菌種，與試驗(yàn)組在同樣條件下發(fā)酵處理7 d?？瞻捉M：將PDA培養(yǎng)基發(fā)酵液滅菌后，與試驗(yàn)組在同樣條件下發(fā)酵處理7 d。

1.5.3 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)物的處理

首先將搖瓶發(fā)酵液在10 000 r/min下離心10 min，取上清液于容量瓶中；然后將20 mL 80%乙醇與沉淀混勻，離心10 min，取上清液于容量瓶中；再將20 mL水與沉淀混勻，離心10 min，取上清液于容量瓶中，定容至刻度，備用。

1.5.4 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）條件

1.5.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取5 mg DNJ標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.5 mg/mL的DNJ樣品對(duì)照溶液。

1.5.4.2 DNJ衍生化

參考唐靜等的方法[35]處理DNJ。取100 μL DNJ樣品對(duì)照溶液（或140 μL發(fā)酵液提取液）于1.5 mL的離心管中，加入0.4 mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH=8.5）169 μL 與10 mmol/L 的 FMOC-Cl乙腈溶液 250 μL，混勻后于30℃恒溫水浴20 min，然后加入1%醋酸溶液66 μL，用水定容，再于 10 000 r/min 離心 3 min（10℃），取上清液過膜，用于HPLC檢測(cè)。

1.5.4.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAXEclipseXDBC18（4.6mm×150mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%冰醋酸（55∶45，體積比），流速：0.8 mL/min，柱溫：30℃；檢測(cè)波長：265 nm。

1.5.5 DNJ目標(biāo)峰的確定

分別吸取100、150 μL DNJ樣品對(duì)照溶液，按照1.5.4.2的方法配置出不同濃度DNJ衍生樣品對(duì)照溶液，同時(shí)，配置無DNJ的單獨(dú)衍生劑樣品對(duì)照溶液；分別進(jìn)樣DNJ衍生樣品對(duì)照溶液與衍生劑樣品對(duì)照溶液，從而確定DNJ目標(biāo)峰位置。

1.5.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

根據(jù)單因素試驗(yàn)，分別精確吸取DNJ樣品對(duì)照溶液 1、3、5、7、9 μL（根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)），按照 1.5.4.2的方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，進(jìn)樣測(cè)定DNJ含量，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一DNJ樣品溶液，衍生化后置于4℃冰箱中保存 2、4、6、12、24 h（根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)）后，進(jìn)樣檢測(cè)并記錄出峰的保留時(shí)間及峰面積，并以峰面積的自然對(duì)數(shù)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.5.8 HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的DNJ

將發(fā)酵提取液按照1.5.4.2進(jìn)行衍生化反應(yīng)，每次準(zhǔn)確吸取20 μL進(jìn)樣檢測(cè)，用外標(biāo)法計(jì)算DNJ含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離及鑒定結(jié)果

桑樹枝條內(nèi)生真菌菌絲生長圖見圖1。

圖1 桑樹枝條內(nèi)生真菌菌絲生長圖Fig.1 The growth of endophyte mycelium in mulberry branch

桑樹枝條內(nèi)生真菌菌絲外觀圖見圖2。

圖2 桑樹枝條內(nèi)生真菌菌絲外觀圖Fig.2 The appearance of endophyte mycelium in mulberry branch

由圖1和圖2可知，試驗(yàn)組桑樹枝條一端生成的菌落為內(nèi)生真菌且為單一菌落。

菌種被寄至北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行鑒定，其結(jié)果如表1所示。

由表1可知，從桑樹中分離的內(nèi)生真菌與Hy－poxylon sp.SUT242具有較高的同源性，其可能屬于Hypoxylon的一個(gè)種。

表1 內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of endophytic fungi

2.2 DNJ目標(biāo)峰的確定結(jié)果

DNJ目標(biāo)峰確定的HPLC圖譜見圖3。

圖3 DNJ目標(biāo)峰確定的HPLC圖譜Fig.3 The determinate HPLC chromatogram of DNJ target peak

通過對(duì)比圖3中3個(gè)色譜圖，含150 μL DNJ衍生樣品對(duì)照溶液在16.5 min左右出現(xiàn)的色譜峰的峰高與峰面積比含100 μL DNJ衍生樣品對(duì)照溶液在16.5 min左右出現(xiàn)的色譜峰高且大，而27.5 min左右出現(xiàn)的色譜峰較??；不含DNJ的FMOC-Cl樣品對(duì)照溶液只在27.5 min左右出現(xiàn)一個(gè)色譜峰，且峰高和峰面積比含DNJ的兩個(gè)在27.5 min左右出現(xiàn)的峰高且大，確定此峰為衍生劑峰，從而確定圖3中a、b色譜圖16.5 min左右出現(xiàn)的色譜峰為目標(biāo)峰，即所需要的DNJ的色譜峰。

由于本試驗(yàn)采用FMOC-Cl柱前衍生高效液相色譜法，衍生劑FMOC-Cl是熒光物質(zhì)且在紫外－可見光區(qū)域具有吸收，其在HPLC檢測(cè)中能夠被檢測(cè)出，因此，圖3中a、b兩個(gè)色譜圖存在兩個(gè)色譜峰。

2.3 DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4為DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=215.14x+103.08，相關(guān)系數(shù)為R2=0.995 7，表明具有良好的線性關(guān)系，符合試驗(yàn)要求。

圖4 DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of DNJ

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of stability experiment

由表2可知，采用FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色譜法檢測(cè)出的DNJ峰面積的RSD為0.32%，表明FMOC-Cl柱前衍生化后溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)樣品中DNJ含量測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3中可知，空白組中未檢測(cè)出DNJ含量，對(duì)照組中DNJ的平均含量為2.987 μg/mL，試驗(yàn)組中菌種發(fā)酵液中未檢測(cè)出DNJ的含量，菌種和桑葉粉末發(fā)酵液中DNJ的平均含量為3.485 μg/mL，較對(duì)照組中DNJ含量高。由此可知該菌種自身無法產(chǎn)生DNJ物質(zhì)，推測(cè)其可將桑葉中的相關(guān)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化為DNJ。試驗(yàn)樣品中DNJ含量測(cè)定色譜圖見圖5。

表3 試驗(yàn)樣品中DNJ含量測(cè)定Table 3 The contents of DNJ in experimental samples

圖5 試驗(yàn)樣品中DNJ含量測(cè)定色譜圖Fig.5 The DNJ content determination chromatograms in experimental samples

由圖5a可知，在16 min～17 min之間未出現(xiàn)DNJ目標(biāo)峰，這是由于PDA液體培養(yǎng)基中不含DNJ物質(zhì)；在27 min后出現(xiàn)了兩個(gè)較高的峰，其原因可能為FMOC-Cl不穩(wěn)定，在水溶液中水解成在檢測(cè)條件下存在熒光吸收的FMOC-OH。FMOC-OH出峰的保留時(shí)間與衍生劑FMOC-Cl的相近，影響衍生劑FMOC-Cl出峰時(shí)間的判斷，對(duì)試驗(yàn)具有干擾作用。

由圖5b可知，在16 min～17 min之間出現(xiàn)DNJ目標(biāo)峰，但此峰存在拖尾現(xiàn)象，并且整個(gè)檢測(cè)過程中出現(xiàn)許多雜峰，其原因?yàn)樯Ｈ~粉末中物質(zhì)種類較多，經(jīng)發(fā)酵處理后，許多物質(zhì)溶解至發(fā)酵液中，且發(fā)酵液未經(jīng)純化處理。

由圖5c可知，在16 min～17 min之間未出現(xiàn)DNJ目標(biāo)峰，這是由于菌種發(fā)酵液中不含DNJ，說明該菌株自身無法產(chǎn)生DNJ。

由圖5d可知，在16 min～17 min之間出現(xiàn)了DNJ目標(biāo)峰，此峰無拖尾現(xiàn)象，但整個(gè)檢測(cè)過程中出現(xiàn)了許多的雜峰，其原因?yàn)樯Ｈ~粉末中物質(zhì)種類較多，經(jīng)過發(fā)酵處理后，菌種代謝產(chǎn)生的其他物質(zhì)，溶解到了發(fā)酵液中，且發(fā)酵液未經(jīng)純化。

3 討論

試驗(yàn)表明，檢測(cè)滅菌效果和選擇表面滅菌的最佳條件對(duì)分離內(nèi)生真菌具有重要的作用。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一個(gè)對(duì)照組檢測(cè)滅菌效果，但其不夠嚴(yán)密，因?yàn)槿绻麣⒕鷱?qiáng)度未達(dá)到殺死組織內(nèi)全部內(nèi)生真菌的程度，內(nèi)生真菌仍舊會(huì)長出，這將會(huì)誤判殺菌強(qiáng)度不足，而表面殺菌強(qiáng)度越強(qiáng)，表皮下滅菌層則越厚，能夠分離到的內(nèi)生真菌越少，生存在更深層、未被殺死的內(nèi)生真菌需要更長的培養(yǎng)時(shí)間穿越殺菌層，生長到植物材料表面。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)桑樹內(nèi)生真菌及其對(duì)桑葉粉末產(chǎn)生DNJ的效果進(jìn)行了初步分析，得出初步結(jié)論：從桑樹枝條中分離出來的內(nèi)生真菌與Hypoxylon sp.SUT242具有較高的同源性，其可能屬于Hypoxylon的一個(gè)種；其在PDA培養(yǎng)基中不能自身產(chǎn)生DNJ物質(zhì)，但能將桑葉中的某些物質(zhì)轉(zhuǎn)化成DNJ。

目前國際市場(chǎng)對(duì)桑葉提取物供不應(yīng)求[36]，實(shí)驗(yàn)室分離檢測(cè)桑樹內(nèi)生真菌的操作不夠成熟。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)可將制備的真菌誘導(dǎo)子加入培養(yǎng)的桑葉愈傷組織中，觀察其是否能夠誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生DNJ物質(zhì)，或者將制備的桑葉懸浮細(xì)胞與內(nèi)生真菌共同培養(yǎng)，研究其與DNJ積累的關(guān)系。桑樹內(nèi)生真菌的分離檢測(cè)及其與DNJ的積累關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。