王麗，石曉麗，楊桂娥

（包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古包頭014060）

沙門氏菌（Salmonella）在我國乃至全球范圍內(nèi)細(xì)菌性食物中毒中占首位，可致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等[1]，人一旦攝入含有大量沙門氏菌（106CFU/g～107CFU/g）的食品，就會引起食物中毒導(dǎo)致的胃腸炎、傷寒和副傷寒。沙門氏菌的傳播媒介多為肉、蛋及其制品，且在與此類食品接觸或食品從加工到出售的過程中都易發(fā)生污染[2]，因此沙門氏菌的檢測對食品安全非常重要。

目前食品中沙門氏菌的檢測方法主要依據(jù)是國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》，該法耗時(shí)較長，過程繁瑣，檢測靈敏度偏低，且易受技術(shù)人員操作水平和經(jīng)驗(yàn)的影響[3-6]，這些弊端使食品安全監(jiān)管的時(shí)效性降低。近年來，為彌補(bǔ)傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測周期長的不足，各種快速檢測方法不斷涌現(xiàn)，如認(rèn)可度較高的實(shí)時(shí)熒光PCR法、生物質(zhì)譜法等[7-14]，而這些方法對儀器有著較高的要求，其普及性并不高。

本研究利用PCR分子層析檢測方法，使用常規(guī)增菌液增菌，通過對不同基質(zhì)的非預(yù)包裝食品的大量試驗(yàn)與結(jié)果數(shù)據(jù)分析，對比傳統(tǒng)國標(biāo)檢測方法的特異性和靈敏度，探索出一個(gè)區(qū)別于傳統(tǒng)檢測方法的有效且快速的沙門氏菌檢測方法。該方法樣品前處理步驟少，使用的擴(kuò)增儀較普通，較大程度地提升了該方法的可操作性及普及性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

腸炎沙門氏菌 CICC21513（Salmonella enteritidis）、大腸埃希氏菌CICC10389（Escherichia coli）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、改良緩沖蛋白胨水（modified buffered peptone water，mBPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、六水氯化鎂、亞硫酸鉍瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；沙門氏菌PCR分子層析測試盒[15-16]（包括1.5 mL裝有預(yù)處理試劑的核酸提取管、緩沖液Buffer B、50 μLPCR試劑管和掌上型的層析卡盒）：上海美凱純生物科技有限公司。

1.1.3 儀器和設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（PR505750R-CN）、水浴培養(yǎng)箱（TSCOL35）、PCR 擴(kuò)增儀（power pac basic）：賽默飛世爾科技公司；立體壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-100SII）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；金屬浴加熱裝置（TMS-300）：杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法的研究

1.2.1 選取的樣品來源

本研究中非預(yù)包裝食品樣品本底采樣于不同超市和市場的散裝售賣點(diǎn)。普通基質(zhì)樣品直接檢測。復(fù)雜基質(zhì)樣品是將涼菜類樣品本底在室溫下放置2 d，待其自然腐敗后進(jìn)行檢測，以模擬自然界的復(fù)雜微生物環(huán)境，涼菜類檢測樣品均為放置2 d后自然腐敗的樣品；生鮮蛋類則挑取了粘附有禽類糞便的樣品。

1.2.2 沙門氏菌檢測

沙門氏菌檢測方法流程見圖1。

圖1 沙門氏菌檢測流程Fig.1 Salmonella detection process

1.2.3 檢測過程

1.2.3.1 樣品處置

非冷凍的易腐樣品若不能及時(shí)檢測，應(yīng)置于2℃～5℃冰箱保存，在24 h內(nèi)檢測。冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15 min或2℃～5℃不超過18 h解凍，若不能及時(shí)檢測，應(yīng)置于-10℃～-20℃保存。

1.2.3.2 樣品制備及增菌

1）普通基質(zhì)樣品

稱取25g（mL）樣品，放入盛有225mLBPW增菌肉湯的無菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min～10 000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，制成樣品勻液。將制備好的樣品放于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8 h～18 h。

2）復(fù)雜基質(zhì)樣品

稱取25 g（mL）樣品，放入盛有225 mL mBPW增菌肉湯的無菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1 min～2 min，制成樣品勻液。將制備好的樣品放于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8 h～18 h。

1.2.3.3 核酸的提取及擴(kuò)增

取培養(yǎng)好的增菌肉湯（普通食品500 μL，香辛料樣品50μL）加到已經(jīng)恢復(fù)到室溫的1.5mL核酸提取管中蓋好，上下顛倒混勻內(nèi)容物或渦旋混勻5 s，（95±2）℃金屬浴或水浴加熱滅活10 min，取出后10 000 r/min離心1 min，室溫冷卻10 min，取出后和下一步加樣前不要搖動(dòng)[注：滅活和未滅活的核酸提取管可以在（-20±2）℃保藏一周]。

從已經(jīng)冷卻的核酸提取管中取5 μL上清液加到已解凍的PCR試劑管中，可室溫解凍（10±1）min，并立即使用，且為避免PCR管之間交叉污染，只在加樣時(shí)打開PCR管，加樣后立即關(guān)閉，10 000 r/min離心10 s，將PCR試劑管放入擴(kuò)增儀，并運(yùn)行相應(yīng)程序（沙門氏菌普通食品用SS，香辛料樣品用SS SPICE）。擴(kuò)增程序設(shè)置見表1。

表1 沙門氏菌擴(kuò)增程序Table 1 Salmonella amplification program

1.2.3.4 層析卡盒檢測及結(jié)果判定

程序運(yùn)行結(jié)束，冷卻后加入4滴緩沖液（buffer B），用200 μL移液槍將PCR擴(kuò)增管內(nèi)全部擴(kuò)增物轉(zhuǎn)移到層析卡加樣窗內(nèi)，等待（2±0.25）min再加4滴buffer B至加樣窗內(nèi)，等待（1±0.25）min，拉動(dòng)檢測卡盒上的開關(guān)，觀察檢測結(jié)果。若出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線，表示層析卡盒工作正常；若質(zhì)控線和檢測線都出現(xiàn)表示沙門氏菌屬陽性；而只出現(xiàn)質(zhì)控線，則表示為陰性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 層析卡盒檢測結(jié)果判定Fig.2 Chromatographic card box detection results determination

2 結(jié)果與分析

2.1 普通基質(zhì)食品中沙門氏菌的檢測結(jié)果與分析

2.1.1 面食制品

取20批不同種類的面食制品（蛋糕、夾心面包、果仁餅干、饅頭、果條、玉米餅、膜片、油餅）各25 g，分別加入225mLBPW增菌肉湯，每批樣品中分別添加1mL不同濃度（10-4～10-7）的沙門氏菌陽性菌液，于（36±1）℃培養(yǎng)18 h后分別用國標(biāo)法GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》和PCR分子層析法同時(shí)檢測，將不同濃度的陽性菌液分別涂布于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。結(jié)果見表2、表3。

表2 不同濃度沙門氏菌陽性菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 The count results of different concentrations of Salmonella positive bacteria suspension

由表3可知，20批不同種類的面食制品比較國標(biāo)法和PCR分子層析法檢測沙門氏菌，添加陽性菌量濃度為10-4和10-5時(shí)，陽性菌數(shù)量偏多，兩種方法均檢出沙門氏菌。當(dāng)添加陽性菌量濃度為10-6和10-7時(shí)，陽性菌數(shù)量偏少或極少，PCR分子層析法檢測結(jié)果為檢出，而國標(biāo)法則為未檢出，由此表明PCR分子層析法比較國標(biāo)法有更低的檢出限和更高的靈敏度。

表3 20批不同種類面食制品比較國標(biāo)法和PCR分子層析法的檢測結(jié)果Table 3 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types pasta products

2.1.2 乳制品

取20批不同種類的乳制品（生牛乳、生羊乳、奶酪、奶豆腐）25 g（mL），加入 225 mL BPW 增菌肉湯，每批樣品中分別添加1 mL不同濃度（10-4～10-7）的沙門氏菌陽性菌液，于（36±1）℃培養(yǎng)18 h后分別用國標(biāo)法和PCR分子層析法同時(shí)檢測，結(jié)果見表4。

表4 20批不同種類乳制品對比國標(biāo)法和PCR分子層析法的檢測結(jié)果Table 4 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types dairy products

由表4可知，20批不同種類的乳制品比較國標(biāo)法和PCR分子層析法檢測沙門氏菌，由于生鮮乳樣品的基質(zhì)相對復(fù)雜，添加陽性菌量濃度為10-5時(shí)，國標(biāo)法未檢出沙門氏菌，PCR分子層析法則同時(shí)在添加陽性菌濃度為10-5、10-6和10-7的樣品中檢出沙門氏菌，由此表明PCR分子層析法的抗干擾性更強(qiáng)，檢測靈敏度更高。

2.1.3 肉制品

取20批不同種類的熟肉制品（豬蹄、雞翅、羊蹄、紅腸、牛肚）25 g，加入225 mL BPW增菌肉湯，每批樣品中分別添加1 mL不同濃度（10-4～10-7）的沙門氏菌陽性菌液，于（36±1）℃培養(yǎng)18 h后分別用國標(biāo)法和PCR分子層析法同時(shí)檢測，結(jié)果見表5。

由表4和表5試驗(yàn)結(jié)果可知，PCR分子層析法測定基質(zhì)相對復(fù)雜的樣品時(shí)，較國標(biāo)法有更好的抗干擾能力，且檢測靈敏度更高，可達(dá)到1 CFU/mL～10 CFU/mL的陽性菌添加濃度。

表5 20批不同種類肉制品對比國標(biāo)法和PCR分子層析法的檢測結(jié)果Table 5 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types meat products

2.1.4 PCR分子層析法檢測沙門氏菌的特異性研究

將沙門氏菌檢測中對其干擾和競爭最多的大腸埃希氏菌作為特異性實(shí)驗(yàn)的干擾菌株，取1 mL濃度為10-5的沙門氏菌菌懸液，加入BPW增菌肉湯，同時(shí)分別加入 1 mL 不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5）的大腸埃希氏菌的菌懸液于（36±1）℃培養(yǎng)18 h后用PCR分子層析法檢測，結(jié)果見表6。

表6 PCR分子層析法檢測沙門氏菌的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Detection of Salmonella specific experiment results by PCR molecular chromatography

由表6可知，在沙門氏菌濃度較低的情況下，不斷增大干擾菌大腸埃希氏菌菌懸液的濃度，最大的添加濃度可到達(dá)10-2，PCR分子層析法均檢出沙門氏菌，表明PCR體系中存在大量其他干擾菌株的DNA時(shí)，并不會影響檢測結(jié)果，可見PCR分子層析法具有較強(qiáng)的特異性和排他性。

2.2 復(fù)雜基質(zhì)與普通基質(zhì)食品中沙門氏菌的檢測結(jié)果與分析的比較研究

2.2.1 涼菜類和生鮮蛋類

分別取20批不同種類的涼菜（面筋涼皮、煮花生、腐竹銀耳、蕨根粉、豆皮）和20批生鮮蛋（雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋且蛋殼表面附帶原糞）25 g，加入225 mL BPW增菌肉湯，對于微生物環(huán)境較為復(fù)雜的食品樣品基質(zhì)，試驗(yàn)中增大了陽性菌菌懸液的添加濃度，以增強(qiáng)沙門氏菌的競爭力。即每一批樣品中分別添加1 mL濃度為 10-2～10-7的沙門氏菌陽性菌菌懸液，于（36±1）℃培養(yǎng)18 h后，分別用國標(biāo)法和PCR分子層析法檢測，結(jié)果見表7、表8。

表7 20批不同種類涼菜對比國標(biāo)法和PCR分子層析法的檢測結(jié)果Table 7 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types cold dishes

由表7可知，用國標(biāo)法和PCR分子層析法同時(shí)檢測20批不同種類的涼菜中的沙門氏菌，當(dāng)添加陽性菌濃度為10-2時(shí)，兩種方法均可檢出沙門氏菌，添加陽性菌濃度降為10-3時(shí)，國標(biāo)法未檢出沙門氏菌，而PCR分子層析法檢出了沙門氏菌?？梢妼τ诨|(zhì)較復(fù)雜的食品，兩種方法的檢測靈敏度明顯下降。

表8 20批不同種類生鮮蛋對比國標(biāo)法和PCR分子層析法的檢測結(jié)果Table 8 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types fresh eggs

由表8可知，用國標(biāo)法和PCR分子層析法同時(shí)檢測20批不同種類的生鮮蛋中的沙門氏菌，與涼菜相比生鮮蛋類樣品基質(zhì)的微生物環(huán)境更為復(fù)雜。當(dāng)添加陽性菌濃度為10-2時(shí)，國標(biāo)法未檢出沙門氏菌，而PCR分子層析法檢出了沙門氏菌。表明樣品基質(zhì)的微生物環(huán)境較復(fù)雜時(shí)，干擾菌對沙門氏菌的抑制和競爭作用增強(qiáng)，使得檢出率和靈敏度均有降低。

2.2.2 增菌液的優(yōu)化研究

為降低復(fù)雜基質(zhì)樣品本底對測定結(jié)果的干擾，用基質(zhì)微生物環(huán)境較復(fù)雜的20批生鮮蛋作為樣本，分別在其增菌液BPW中加入六水氯化鎂、碳酸鈣以及檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉，進(jìn)行了比對試驗(yàn)。比對結(jié)果顯示，在BPW中加入六水氯化鎂的增菌液（mBPW），對生鮮蛋樣本的增菌效果較理想，可使PCR分子層析法的檢測靈敏度有顯著提高。結(jié)果見表9。

表9 20批生鮮蛋增菌液優(yōu)化前后PCR分子層析法檢測結(jié)果Table 9 The comparation of the detection results on 20 batches fresh eggs before and after optimization of increase microbial liquid by PCR molecular chromatography

由表9可知，使用優(yōu)化后的增菌液mBPW，PCR分子層析法檢測陽性菌添加濃度由10-2降低至10-4，檢測靈敏度得到提高，相比優(yōu)化前提高了100倍。對于基質(zhì)較復(fù)雜的食品可以采用PCR分子層析法結(jié)合改良增菌液進(jìn)行檢測。

3 討論與結(jié)論

沙門氏菌的種類繁多，生存力強(qiáng)，在20℃以上即可大量繁殖。隨著食品售賣方式的多樣化，尤其對于基質(zhì)相對復(fù)雜的非預(yù)包裝食品來說，對其生物污染的及時(shí)檢測顯得尤為重要，如何快速準(zhǔn)確地檢出污染微生物是預(yù)防和控制食品安全問題的重要環(huán)節(jié)。

傳統(tǒng)的檢測技術(shù)在沙門氏菌的分離過程中存在一定的不確定性，檢驗(yàn)步驟耗時(shí)較長，易受環(huán)境和微生物活性影響，且對檢驗(yàn)人員的檢驗(yàn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)均有較高要求，不能很好地與食品安全所需的“及時(shí)準(zhǔn)確”相適應(yīng)。

目前的沙門氏菌檢驗(yàn)技術(shù)，包括分子生物學(xué)技術(shù)、生物傳感器檢測技術(shù)、質(zhì)譜檢測技術(shù)等，一是對人員操作能力有要求，二是儀器操作相對復(fù)雜，三是樣品處理復(fù)雜。因此，對沙門氏菌的快速檢測技術(shù)和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用研究，成為食品安全檢測發(fā)展的重要方向[17-22]。

本研究相比其他快速檢測方法，具有較高特異性和靈敏度的優(yōu)勢，且準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性也較好。應(yīng)用PCR分子層析技術(shù)檢測沙門氏菌有其獨(dú)特的優(yōu)勢，一是樣品前處理步驟少，不需要樣品純化和復(fù)雜的DNA提取，操作簡單，不易受環(huán)境影響；二是檢測靈敏度可達(dá)到陽性菌最低添加濃度10 CFU/mL；三是時(shí)效性大大提高，PCR分子層析法檢測周期比傳統(tǒng)國標(biāo)方法檢測周期快了6倍左右，彌補(bǔ)了沙門氏菌國標(biāo)檢測方法周期長的不足，提高了沙門氏菌檢測的時(shí)效性；四是本方法所使用的擴(kuò)增儀是食品檢測實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配置的儀器，價(jià)格不高，便于方法的普及推廣。