劉瑞，張弘弛，*，延文星，周鳳，李慧

（1.大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009；2.大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西大同037009）

在20世紀(jì)70年代，國外在醫(yī)藥行業(yè)、污水處理行業(yè)就廣泛地使用了大孔吸附樹脂用以除去污水中的有害物質(zhì)，分離天然藥物中的有效成分。其吸附分離過程綜合了機(jī)械篩分和化學(xué)吸附原理，具有吸附性獨(dú)特、選擇性高、不受無機(jī)物影響、使用周期長、節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于皂苷類物質(zhì)的提取[1-2]。有關(guān)大孔樹脂對中藥中皂苷類和黃酮類成分純化的報道已有不少，但對黃芪中總皂苷類成分的相關(guān)報道相對較少[3-4]。

在我國的內(nèi)蒙包頭、山西渾源、甘肅隴西、山東萊陽等地均有黃芪生長。其中以山西渾源、甘肅隴西的黃芪最為有名，且藥用價值最高。黃芪皂苷是黃芪中的重要生理活性物質(zhì)，但不同年份、不同產(chǎn)地、不同品種的黃芪中皂苷含量均不相同，導(dǎo)致市面上的黃芪質(zhì)量參差不齊，很難形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；l(fā)展[5]。如今，中藥制劑化發(fā)展迅速，把傳統(tǒng)中藥中的生理活性物質(zhì)提純后作為藥品更有利于藥劑師和醫(yī)生的精確用藥，從而更加有利于傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代化。市面上高純度的黃芪皂苷每克售價均在200元～300元，黃芪中總皂苷的含量為7.5 mg/g～17.2 mg/g，因此提純黃芪中的各種皂苷活性物質(zhì)具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。一般采用的提取黃芪總皂苷的方法為回流提取法，這種方法存在提取速度慢、黃芪總皂苷含量不高、分離成本較高等缺點(diǎn)。而大孔樹脂法分離黃芪總皂苷可有效降低成本，提高提取速度和黃芪總皂苷的含量，因此對黃芪總皂苷的大孔樹脂分離純化和富集的方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究和工藝優(yōu)化。

1 材料和儀器

黃芪根（粉碎后試驗）：山西渾源萬生黃芪開發(fā)有限公司；黃芪甲苷對照品（編號Z0371312）：北京譜析科技有限公司；XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101 樹脂、無水乙醇、乙酸、香草醛、高氯酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試劑均為分析純。

XFB-200型小型中藥粉碎機(jī)：吉首中誠制藥廠；HH-3三孔三控溫水槽、T650CT雙頭恒溫超聲波提取機(jī)：上海左樂儀器有限公司；SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：西安禾普生物科技有限公司；UV-3200S紫外分光光度計：上海美國譜達(dá)儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 黃芪總皂苷的測定

2.1.1 黃芪總皂苷的提取及檢測方法

在微量天平（千分之一）上稱取20 g黃芪粉末，按照1∶20（g/mL）加入濃度75%的乙醇溶液，將提取液置于超聲波破碎儀中（功率設(shè)置200 W），超聲助溶后，放入25℃的恒溫?fù)u床120 r/min增加其溶解效果（振蕩12 h），將提取液在定性濾紙上進(jìn)行抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至錐形瓶備用。參照文獻(xiàn)[6]的香草醛－高氯酸比色法測定黃芪總皂苷含量。

2.1.2 最佳吸收波長的選擇及黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用超微量天平稱取3 mg黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，按照上述方法進(jìn)行顯色反應(yīng)。以相應(yīng)的空白對照分別在紫外可見分光光度計上進(jìn)行全波長掃描，測出顯色反應(yīng)之后的最大吸收波長。用移液槍量取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL黃芪甲苷樣品液置于試管中，再加入95%的乙醇定容至1 mL，顯色。其中，1號試管中的溶液為空白對照。

2.2 靜態(tài)吸附和脫附試驗

2.2.1 不同樹脂吸附解吸篩選試驗

準(zhǔn)確稱取XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101樹脂0.5 g，分別置于150 mL三角瓶中依次標(biāo)號1～7，在每個三角瓶中準(zhǔn)確加入黃芪提取液50 mL，將其轉(zhuǎn)移至恒溫?fù)u床中振蕩吸附12 h（120 r/min、25℃），將吸附后液體用于測定黃芪總皂苷含量，按如下公式計算吸附量。將飽和吸附后的各型號樹脂用去離子水清洗3遍分別置于50 mL燒杯中，用移液管準(zhǔn)確量取95%乙醇50 mL放入燒杯，解吸12 h，測出黃芪總皂苷含量，按如下公式計算解吸量和解吸率。

式中：Qe為干樹脂的吸附量，mg/g；Qd為干樹脂的解吸量，mg/g；D為解吸率，%；C0為黃酮提取液的初始濃度，mg/mL；Vi為黃酮樣品液的初始體積，mL；Ce為吸附平衡后的每毫升溶液中黃酮的濃度，mg/mL；Cd為解吸液的濃度，mg/mL；Vd為解吸液的體積，mL；W為樹脂的干重，g。

2.2.2 在所選樹脂上的吸附動力學(xué)平衡的建立

將50 mL樣品溶液加入到150 mL的三角瓶中，加入提前稱重的所選大孔樹脂（等于0.5 g干樹脂）。三角瓶在搖床上以25℃，120 r/min振蕩。每隔30 min測試吸附液中黃芪總皂苷的濃度，直到達(dá)到吸附平衡，得到吸附動力學(xué)曲線。

通過偽一階和偽二階模型的適用性，預(yù)測了吸附過程中所涉及的機(jī)理。偽一階和偽二階模型可由以下數(shù)學(xué)公式表示：

式中：Qe為達(dá)到吸附平衡時每克吸附劑中溶質(zhì)的濃度，也就是吸附能力，mg/g；Qt為t時刻每克吸附劑中溶質(zhì)的濃度，mg/g；k1和k2分別是偽一階和偽二階速率常數(shù)。設(shè)定初始條件為t＝0，Qt＝0時，兩個動力力學(xué)方程具有解吸解。如下：

2.2.3 提取液pH值影響黃芪總皂苷吸附量的試驗

準(zhǔn)確稱取5組0.5 g樹脂置于150 mL三角瓶中，依次標(biāo)號1～5，按照不同的pH值將黃芪總皂苷提取液加入到 1～5號錐形瓶中，pH值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將其轉(zhuǎn)移至恒溫?fù)u床中振蕩吸附12 h（120 r/min、25℃），將吸附后液體，測出黃芪總皂苷含量。

2.2.4 黃芪總皂苷吸附模型（吸附等溫線）的測定

在千分之一天平上準(zhǔn)確稱取0.5 g干樹脂15組，轉(zhuǎn)移至三角瓶中依次標(biāo)號1～15，每3組加入相同初始濃度的黃芪提取液50 mL，將加入不同濃度樣液的三角瓶同批放入恒溫?fù)u床中振蕩吸附12 h（120 r/min），溫度分別設(shè)置為20、25、30℃，測出黃芪總皂苷含量。

2.2.5 吸附時間影響黃芪總皂苷吸附量的試驗

在千分之一天平上準(zhǔn)確稱取0.5 g干樹脂，加入50 mL黃芪提取液置于恒溫?fù)u床中振蕩吸附（25℃，120 r/min），每隔30 min取樣0.5 mL，測出黃芪總皂苷含量。

2.3 動態(tài)吸附和脫附試驗

采用預(yù)處理后的水合樹脂（3 g干樹脂）進(jìn)行動態(tài)吸附和解吸試驗。

2.3.1 裝載量的優(yōu)化（動態(tài)泄露曲線的測定）

用預(yù)處理的所選樹脂在濕式玻璃柱上裝柱，將黃芪提取液加于柱頂，研究最大裝載量?？刂屏魉贋?.0 BV/h，分段收集流出液，每份5 mL，測定流出的液體中黃芪總皂苷的濃度，得到動態(tài)泄露曲線。

2.3.2 洗脫液濃度的優(yōu)化

用預(yù)處理所選樹脂在濕式玻璃柱上裝柱，用之前制備黃芪提取液逐滴上樣，用30%～90%濃度的乙醇進(jìn)行梯度洗脫。測定流出的液體中黃芪總皂苷的濃度，選出最佳的洗脫液濃度。

2.3.3 洗脫液流速的優(yōu)化

用預(yù)處理所選樹脂在濕式玻璃柱上裝柱，用黃芪提取液上樣，取1 BV洗脫液，分別控制洗脫液流速為1.0、1.5、3.0 BV/h，測定洗脫液中黃芪總皂苷的濃度，計算解吸量。

3 結(jié)果與分析

3.1 測定最大吸收波長及標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果

提取液顯色后進(jìn)行全波長掃描，測出的最大吸收波長為585 nm。橫軸為黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的濃度值，縱軸為試驗測定的吸光度值，用origin 8.0制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.044 2x+0.013 6（r＝0.996），式中：y為吸光度值；x為黃芪總皂苷濃度，μg/mL。此方程具有良好的線性關(guān)系。

3.2 靜態(tài)吸附和脫附試驗結(jié)果

3.2.1 各型號樹脂的黃芪總皂苷吸附解吸結(jié)果

不同大孔樹脂對黃芪總皂苷的吸附能力、解吸能力和解吸率見圖1。

圖1 不同大孔樹脂對黃芪總皂苷的吸附能力、解吸能力和解吸率Fig.1 Adsorption capacity，dissociation capacity and dissociation rate of different macroporous resins for astragalus saponins

選擇大孔樹脂時要求樹脂對目標(biāo)皂苷吸附容量大、選擇性高、吸附速率快、解吸容易并且再生容易。吸附容量和吸附速率可采用靜態(tài)吸附法確定各型號樹脂吸附和解吸黃芪總皂苷的含量及解吸率[7]。如圖1所示，從吸附效果和解吸效果來看，XDA-4樹脂都明顯好于其它樹脂，故選用XDA-4型樹脂進(jìn)行后續(xù)試驗。

3.2.2 黃芪總皂苷在XDA-4樹脂的吸附動力學(xué)

黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的吸附動力學(xué)曲線，擬一階動力學(xué)模型和擬二階動力學(xué)模型的相關(guān)線形圖見圖2。

圖2 黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的吸附動力學(xué)曲線，擬一階動力學(xué)模型和擬二階動力學(xué)模型的相關(guān)線形圖Fig.2 The adsorption kinetics curve of astragalus saponins on XDA-4 resin and the correlation line graph of the pseudo-firstorder kinetics model and the pseudo-second-order kinetics model

接觸時間是決定吸附行為的另一個重要因素。為了評價接觸時間對吸附性能的影響，得到了黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的吸附動力學(xué)曲線（圖2a）。大孔樹脂對皂苷類成分吸附速率的快慢可以通過靜態(tài)吸附試驗測定。黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的吸附量在初始的240 min隨吸附時間的延長而迅速增長，在250 min后達(dá)到動態(tài)平衡。因此在后續(xù)試驗中采用240 min的吸附時間較為合適。

參照文獻(xiàn)中試驗常采用假一級動力學(xué)方程或假二級動力學(xué)方程進(jìn)行擬合[8]。大孔樹脂的動態(tài)吸附過程可以采用General rate model（GR模型）[9]。該模型考慮了各種影響色譜傳質(zhì)的因素，具有普適性，但是形式較為復(fù)雜。因未有色譜精制皂苷類成分的數(shù)學(xué)建模研究，本研究比較了Guiochon等綜述的多種GR模型的簡化形式[10]，最終選擇了“l(fā)g（Qe-Qt）與t”和“t/Qt與t”的關(guān)系曲線?！發(fā)g（Qe-Qt）與t”和“t/Qt與t”的關(guān)系曲線如圖2b和2c所示，從這些曲線的斜率計算出k1和k2的值，用擬二階動力學(xué)模型解釋了黃芪總皂苷在XDA-4樹脂的吸附情況，得出黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的吸附動力模型如下：

擬一階動力學(xué)方程：

t/Qe=7.046 83t+0.687 1，R2=0.882 89

擬二階動力學(xué)方程：

lg（Qe-Qt）=-0.0418t+1.090 93，R2=0.984 2

3.2.3 提取液pH值對吸附量的影響

上樣時樣品的pH值是決定吸附行為的一個重要因素，為了解上樣時pH值對吸附性能的影響，得到了黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的吸附量隨pH值的變化，見圖3。

圖3 XDA-4樹脂在不同pH值條件下對黃芪總皂苷的吸附能力Fig.3 Adsorption capacity of XDA-4 resin on astragalus saponins at different pH values

如圖3所示，pH值從5.0上升至7.0的過程中吸附量明顯上升，但隨著pH值的繼續(xù)上升吸附量卻急劇下降，因此選擇接近中性的樣液進(jìn)行上樣比較合適。黃芪提取液的初始pH值為7.06，因此，在上樣過程中無需調(diào)整pH值。

3.2.4 黃芪總皂苷在XDA-4上的吸附模型（吸附等溫線）的建立

對于不同樹脂和藥液使用Langmuir方程或Freundlich方程擬合結(jié)果的優(yōu)劣可能不同[9]。為了選出最佳的上樣條件，建立了Langmuir等溫線和Freundlich等溫線，見表1。吸附等溫線見圖4。

表1 不同溫度下黃芪總皂苷在XDA-4大孔樹脂上的Langmuir方程和Freundlich方程Table 1 Langmuir isotherm and Freundlich isotherm of the adsorption capacity curve of astragalus saponins on XDA-4 resin at different temperture

經(jīng)過建立吸附模型，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)在20℃下，上樣濃度為0.72 mg/mL吸附效果最好。

3.3 動態(tài)吸附和脫附試驗結(jié)果

3.3.1 裝載量的優(yōu)化結(jié)果

黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的動態(tài)泄露曲線見圖5。

圖4 黃芪總皂苷在20、25、30℃XDA-4樹脂上的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms for total astragalus saponins on XDA-4 resin at 20，25，30℃

圖5 黃芪總皂苷在XDA-4樹脂上的動態(tài)泄露曲線Fig.5 Dynamic leakage curve of astragalus saponins on XDA-4 resin

如圖5所示，隨著黃芪提取液裝柱體積的增加，流出液中的黃芪總皂苷的濃度也在不斷的增加，吸附率會逐漸降低，當(dāng)流出液收集到80 mL的時候洗脫液中黃芪總皂苷的濃度迅速增加，表明此時已經(jīng)達(dá)到泄漏點(diǎn)。因此，選擇上樣體積為80 mL。

3.3.2 洗脫液濃度的優(yōu)化結(jié)果

洗脫液濃度初步優(yōu)化結(jié)果見圖6。

圖6 不同濃度乙醇溶液對XDA-4樹脂洗脫能力的影響Fig.6 Effect of different ratio of ethanol solution on elution capacity on XDA-4 resin

圖6表明，當(dāng)乙醇濃度小于40%，對黃芪總皂苷的洗脫能力很弱，乙醇濃度在40%～80%之間，對黃芪總皂苷的洗脫能力隨著乙醇濃度的升高而提升，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時，黃芪總皂苷在乙醇洗脫液中的濃度明顯提高，且在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，分不同濃度乙醇洗脫，可以在皂苷損失很少的情況下除去更多雜質(zhì)，而乙醇比例達(dá)到80%之前，洗脫能力明顯提高，80%之后洗脫能力變化不大，選擇80%乙醇為最佳洗脫劑。所以，在后續(xù)的常規(guī)優(yōu)化過程中先選用40%～60%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再使用80%乙醇洗脫，富集高濃度黃芪總皂苷。這一結(jié)果與杜海勝等[11]用HPD400-A樹脂純化胡蘆巴總皂苷類似，水洗滌之后采用低體積分?jǐn)?shù)乙醇（30%）進(jìn)行第2次洗滌，在皂苷損失很少的情況下除去更多雜質(zhì)。

3.3.3 洗脫流速優(yōu)化結(jié)果

累積解吸率隨解吸液體積變化曲線和累積解吸率隨時間變化曲線見圖7。

圖7 累積解吸率隨解吸液體積變化曲線和累積解吸率隨時間變化曲線Fig.7 Curve of cumulative dissociation rate with dissociated liquid product and curve of cumulative dissociation rate with time

為了有效地從樹脂中解吸出黃芪總皂苷，一個合適的流速十分必要，Yamamoto等[12]線性增加的解吸劑能增加不同成分的分離度。解吸流速的選擇需要綜合考慮解吸劑消耗和時間消耗，F(xiàn)u等[13]研究結(jié)果表明，較低的解吸流速可以減少解吸劑用量，但消耗的時間明顯增加。從圖7可以看出，當(dāng)洗脫劑流速在1 BV/h和1.5 BV/h時，洗脫液中黃芪總皂苷的濃度較高。隨著流速增快，解吸率明顯下降，因此選擇洗脫流速為1.5 BV/h較為合適。

4 結(jié)論和討論

本試驗前期進(jìn)行了靜態(tài)吸附試驗和靜態(tài)解吸試驗，優(yōu)選了樹脂型號、吸附溫度、吸附時間、上樣pH值等參數(shù)，進(jìn)一步進(jìn)行吸附/脫附試驗，優(yōu)化洗脫液濃度、脫附流量。XDA-4型大孔吸附樹脂對黃芪中黃芪總皂苷吸附和分離性能最強(qiáng)，通過吸附動力學(xué)分析和吸附模型的建立，得出其最佳工藝為：黃芪提取液中的黃芪總皂苷的濃度控制在0.72 mg/mL，無需額外調(diào)節(jié)其pH值，上樣體積為80 mL，吸附時間不少于240 min，80%乙醇以1.5 BV/h的速度進(jìn)行洗脫。

Wan等[14]用 DS-401樹脂精制三七皂苷，先用30%乙醇解吸人參三醇型皂苷，再用80%乙醇解吸人參二醇型皂苷，實現(xiàn)了兩大類皂苷的分離。本研究中未涉及分步實現(xiàn)多種黃芪皂苷的同步分離，在本研究基礎(chǔ)上，后續(xù)將繼續(xù)精細(xì)大孔樹脂的分離工藝，期望實現(xiàn)同步分批多類型黃芪皂苷的分離。

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)在保持樹脂干重相同的情況下，裝柱后測得的裝床體積每次都有不同程度的變化。查閱資料后發(fā)現(xiàn)活化大孔樹脂時乙醇的濃度、活化時的溫度、活化時間都對大孔樹脂的膨脹率有明顯影響。因此，在之后的活化過程中將乙醇濃度固定在80%，置于20℃的恒溫?fù)u床中活化4 h，之后的柱床體積基本保持不變。在動態(tài)吸附的研究過程中，上樣完成后用6倍柱床體積的去離子水洗去未吸附的提取液后，發(fā)現(xiàn)大孔樹脂出現(xiàn)漂浮的情況并且柱床中出現(xiàn)了零零散散的氣泡?？紤]到經(jīng)過乙醇活化后的大孔樹脂密度明顯低于水的密度才會出現(xiàn)這種情況，因此在之后的清洗過程中先逐滴加入去離子水，待不再出現(xiàn)大孔樹脂大量漂浮的情況后再大量加入去離子水。而柱床中出現(xiàn)氣泡的情況可能是由于去離子水流速過快導(dǎo)致，在之后的清洗過程中降低去離子水的流速，并用吸耳球不斷敲擊層析柱使氣泡分離出去，之后便不再出現(xiàn)這種情況。在試驗中為節(jié)約大孔樹脂，所使用過的樹脂都應(yīng)該進(jìn)行再生[15]后重復(fù)利用。

黃芪總皂苷含量較低，各產(chǎn)地藥材間差別較大[16]，質(zhì)量控制較為困難，經(jīng)過大孔樹脂分離方法優(yōu)化可有效解決以上問題。大孔樹脂層析法處理后黃芪總皂苷濃度明顯提高，該方法有無毒、成本低、高效、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。