郭立群，林詠皓，于淼，林詠翔，徐鶴然，王敏，*

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京100048；2.百岳特生物科技（上海）有限公司，上海201306）

皮膚作為人體的第一道屏障，也是人體衰老的最直觀表現(xiàn)之一，其老化是一種多因素的變化過程。基因組及激素等內(nèi)在因素和紫外線、污染等外在因素均會(huì)使皮膚組織和相關(guān)附屬器官發(fā)生生理或病理性的老化損傷。此外，組織及細(xì)胞內(nèi)部的氧化和糖化反應(yīng)也會(huì)對(duì)細(xì)胞及組織造成不同程度的損傷[1]。多余的糖分在體內(nèi)積累會(huì)形成黃棕色、熒光性、不可逆的糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），而AGEs的過量積累則對(duì)真皮層的胞外基質(zhì)膠原蛋白造成損傷，破壞皮膚結(jié)構(gòu)及彈性[2]。隨著年齡增長(zhǎng)及自然老化的發(fā)生，單位皮膚面積的膠原蛋白含量每年約流失1%，體內(nèi)的AGEs亦逐年提升1.2%[3]。除生理性因素外，外界刺激因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激也會(huì)通過生成大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）與糖化反應(yīng)產(chǎn)生互作。細(xì)胞在正常生理代謝下，可通過自身的抗氧化系統(tǒng)清除過量的ROS以防止氧化損傷的發(fā)生，但當(dāng)ROS的積累超過系統(tǒng)承受限度時(shí)，就會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激[4]，使細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA受到不同程度的損傷。體內(nèi)AGEs過量累積也可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生并消耗超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、維生素C等抗氧化成分，進(jìn)而影響糖化抑制系統(tǒng)Glo I的能力，促進(jìn)糖化過程的發(fā)生[5]。AGEs的形成導(dǎo)致皮膚細(xì)胞彈性降低，同時(shí)細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)更強(qiáng)烈，從而產(chǎn)生更多的活性氧自由基。因此，體內(nèi)糖基化常伴隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)。除皮膚老化外，過量的AGEs也會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、阿爾茲海默癥及動(dòng)脈硬化等一系列問題[6]。

紅藜（Chenopodium formosanum）為莧科藜亞科藜屬植物，被譽(yù)為“谷物中的紅寶石”，富含多酚與黃酮類[7-8]，甜菜紅素、甜菜黃素等抗氧化成分，也富含多種必需氨基酸和營(yíng)養(yǎng)元素，可用作天然的著色劑和抗氧化劑。紅藜提取物中主要包含蘆丁、山奈酚、甜菜堿等20多種化合物，使其具有抗氧化、促進(jìn)膠原蛋白生成、減少細(xì)胞凋亡、抗炎、抑制黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]和保護(hù)及修復(fù)受損肝臟的作用[10]。蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench.）為蓼科蕎麥屬植物，又名三角麥、烏麥[11]，起源于中國(guó)西漢，是一種歷史悠久的藥食同源植物，在《本草綱目》、《齊民要術(shù)》等醫(yī)書古籍上均有記載，具有很高的醫(yī)用、營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12-13]。蕎麥富含蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素等物質(zhì)，維生素B2的含量可達(dá)其他糧食4倍～24倍，且含有其他禾谷類糧食所沒有的葉綠素、蘆丁[14-15]。因此，蕎麥具有增進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗氧化、防止血細(xì)胞的凝集、使毛細(xì)血管的通透性及脆性下降、降血壓、降血脂、改善人體免疫能力、抗癌、抗腫瘤、預(yù)防老年癡呆、抗糖化等作用[16-17]。因此，紅藜和蕎麥均因其所具有的良好抗氧化及抑制炎性反應(yīng)而被應(yīng)用于保健食品中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅藜提取物、蕎麥種皮提取物：大江生醫(yī)股份有限公司；紅藜果味飲料：美樂家（中國(guó)）日用品有限公司。

人皮膚成纖維細(xì)胞（HFF-1）：中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；高糖培養(yǎng)基（DMEM）：美國(guó)GIBCO公司；ROS試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人晚期糖基化終末產(chǎn)物、糖基化牛血清白蛋白（AGE-BSA）、膠原蛋白Ⅲ試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。

受試者依據(jù)測(cè)試要求選取，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥、粗糙、肌膚暗黃者，近2年內(nèi)未做過激光美容或化學(xué)煥膚，對(duì)護(hù)膚類化妝品無既往過敏史，無倫理學(xué)禁忌，測(cè)試期間受試者不得使用與產(chǎn)品功能相似的化妝品，性別隨機(jī)，年齡35歲～55歲。自愿簽署知情同意書，并要求在測(cè)試周期內(nèi)，避免長(zhǎng)時(shí)間日曬、戶外運(yùn)動(dòng)、游泳、旅游等活動(dòng)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司；DIRECT HEAT CO2Incubator恒溫培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技公司；實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（real-time cell assay，RTCA）：美國(guó)艾森生物科學(xué)公司；Corneometer CM 825皮膚水分含量測(cè)試儀、GL 200&MPA 10皮膚光澤度測(cè)試儀、CL 400&MPA 10皮膚色差測(cè)試探頭及多探頭皮膚測(cè)試系統(tǒng)：德國(guó)C&K；面部圖像分析系統(tǒng)VISIA-CR：美國(guó)Canfield；皮膚快速光學(xué)成像系統(tǒng)Derma TOP：法國(guó) EO-TECH。

1.2 HFF-1細(xì)胞活性氧含量檢測(cè)

在每個(gè)樣品組加入適當(dāng)?shù)腄CFH-DA的無血清培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱避光孵育30 min，使之與HFF-1充分接觸，30 min后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗探針，加入適量培養(yǎng)基進(jìn)行吸光值檢測(cè)，檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm。計(jì)算方式：ROS含量/%＝樣品組/陰性組×100。并用熒光顯微鏡對(duì)處理后細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行拍照，用以分析。

1.3 HFF-1細(xì)胞抗糖化評(píng)價(jià)

用含10%小牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基將HFF-1細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（空白）、陽性對(duì)照組（100 μg/mL VC）、樣品組（不同濃度樣品干預(yù)）、AGEs組（5mg/mL）、BSA 組（AGEs的對(duì)照組，5mg/mL）。AGEs和AGEs-BSA溶液損傷HFF-1細(xì)胞24 h，利用安全濃度下測(cè)試樣品進(jìn)行修復(fù)；根據(jù)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（real-time cell assay，RTCA）自動(dòng)生成的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線計(jì)算存活率。同時(shí)利用通過上述方法造模72 h后的細(xì)胞上清液，按照膠原蛋白Ⅲ試劑盒說明書測(cè)定膠原蛋白Ⅲ含量，用于后續(xù)的分析。

1.4 臨床功效評(píng)價(jià)

受試者完成皮膚本底值采集和問卷填寫后，采集使用前的本地?cái)?shù)據(jù)并領(lǐng)取測(cè)試產(chǎn)品，采用飲用樣品前后自身對(duì)照的臨床試驗(yàn)，使用頻率為每日一瓶。隨后采取使用4周、6周后的面部皮膚數(shù)據(jù)，且測(cè)試期間不得使用與測(cè)試產(chǎn)品功能相類似的化妝品。分別對(duì)受試者使用前后的眼角皺紋深度、皮膚水分含量、皮膚光澤度、皮膚顏色L*值及b*值進(jìn)行測(cè)量評(píng)價(jià)并采集正面面部圖像，使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布計(jì)算，使用t檢驗(yàn)的方法分析測(cè)試產(chǎn)品使用前后皮膚數(shù)據(jù)的變化，如果數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)上述統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果做出測(cè)試產(chǎn)品是否有效的結(jié)論，雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

變化率即相對(duì)使用前的變化率，計(jì)算公式如下：

式中：T0為受試區(qū)使用化妝品前皮膚本底值；Tn為受試區(qū)使用化妝品后皮膚數(shù)值；n為回訪時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅藜-蕎麥提取物修復(fù)HFF-1糖化損傷

在體外培養(yǎng)的HFF-1細(xì)胞中，加入不同濃度的紅藜-蕎麥提取物，實(shí)時(shí)觀察48 h后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖1，選取細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量大于90%時(shí)的處理濃度3.125%作為安全濃度用于后續(xù)測(cè)試。

圖1 不同濃度紅藜-蕎麥提取物作用HFF-1細(xì)胞48 h生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of different concentrations of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts acting on HFF-1 cells for 48 h

2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）作為一種氧化應(yīng)激指示劑，能自由透過細(xì)胞膜，本身無熒光，但進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞酯酶水解生成DCFH，之后與細(xì)胞內(nèi)ROS快速氧化生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物（dichlorofluorescein，DCF）。不同濃度紅藜-蕎麥提取物對(duì)活性氧（ROS）的清除能力見圖2。

圖2 不同濃度紅藜-蕎麥提取物對(duì)HFF-1細(xì)胞活性氧清除作用Fig.2 Scavenging effects of different concentrations of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts on reactive oxygen species（ROS）in HFF-1 cells

由圖2所知，與陰性對(duì)照組相比，1.56%紅藜-蕎麥提取物反應(yīng)后熒光面積較小。同時(shí)，不同濃度的紅藜-蕎麥提取物對(duì)ROS抑制率均高于陽性對(duì)照組（VC溶液，100 μg/mL）。提取物混合液濃度為1.56%時(shí)清除率最佳，達(dá)60.5%）。結(jié)合數(shù)據(jù)分析證明，紅藜-蕎麥提取物在體外培養(yǎng)的HFF-1細(xì)胞模型中具有高效清除活性氧自由基的能力。

AGEs產(chǎn)物在體內(nèi)過量累積會(huì)導(dǎo)致組織內(nèi)膠原蛋白變性脆弱，也會(huì)使膠原蛋白Ⅲ等成分含量發(fā)生變化。因此，本試驗(yàn)使用外源AGEs產(chǎn)物在體外培養(yǎng)HFF-1細(xì)胞上建立糖化損傷模型。紅藜-蕎麥提取物修復(fù)AGEs損傷模型下細(xì)胞實(shí)時(shí)生長(zhǎng)曲線見圖3，不同濃度紅藜-蕎麥提取物在修復(fù)AGEs損傷下的膠原蛋白Ⅲ含量差異對(duì)比見圖4。

由圖4可知，外源AGEs的加入可降低細(xì)胞中膠原蛋白Ⅲ的含量。與陰性對(duì)照組相比，當(dāng)混合物濃度大于1.56%時(shí)，可修復(fù)因AGEs損傷造成的膠原蛋白Ⅲ含量減少，且隨樣品濃度增加，對(duì)膠原蛋白損傷的修復(fù)能力增強(qiáng)。

2.2 受試者使用評(píng)價(jià)

2.2.1 皮膚水分含量及皺紋深度變化

圖3 紅藜-蕎麥提取物修復(fù)HFF-1細(xì)胞AGEs損傷模型下細(xì)胞實(shí)時(shí)生長(zhǎng)曲線Fig.3 Real-time growth curve of repairing HFF-1 cells under AGEs injury model by mixture of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts

圖4 不同濃度紅藜-蕎麥提取物在修復(fù)HFF-1細(xì)胞AGEs損傷模型中膠原蛋白Ⅲ含量差異Fig.4 Collagen III content in different concentrations of Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts mixture in repairing HFF-1 cells under AGEs injury model

受到糖化產(chǎn)物和氧化自由基等應(yīng)激等損傷后，皮膚組織中膠原和彈性蛋白纖維脆弱變性，導(dǎo)致皮膚組織的松弛度增加，出現(xiàn)皺紋等衰老指征，同時(shí)皮膚表層水分含量的變化也與其密切相關(guān)[18]。本試驗(yàn)選取30名符合要求的受試者，使用以紅藜-蕎麥提取物為主要原料的抗糖化飲品6周，并追蹤測(cè)試周期內(nèi)的皮膚水分、皺紋、光澤度等指標(biāo)，以觀察皮膚狀態(tài)改善情況。使用飲品前后受試者皮膚中水分含量值的變化由皮膚水分含量變化率表示。當(dāng)水分含量發(fā)生變化時(shí)，皮膚的電容值亦發(fā)生變化，此值越高，說明產(chǎn)品補(bǔ)水保濕效果越明顯。受試者使用飲品前、連續(xù)使用4周、6周后，經(jīng)Corneometer CM 825儀器檢測(cè)皮膚水分含量、Derma TOP儀器檢測(cè)眼角皺紋深度，皮膚變化對(duì)比見表1。

表1 皮膚水分含量及眼角皺紋深度使用前后對(duì)比Table 1 Skin moisture content and eye wrinkle depth before and after application

如表1所示，相同測(cè)試區(qū)域內(nèi)皮膚水分含量隨飲品飲用時(shí)間逐漸升高，在飲用飲品6周后高于飲用前，且存在顯著性差異（p<0.01）。

受試者使用紅藜-蕎麥提取物飲品前后，測(cè)試部位皮膚水分及眼角皺紋變化見圖5。

圖5 受試者使用紅藜-喬麥提取物飲品前后面部皮膚水分及眼角皺紋變化Fig.5 Changes in facial skin moisture and wrinkles a round the eyes before and after the subjects used sorghum Chenopodium formosanum- Fagopyrum esculentum Moench. extracts

由圖5 A、圖5B所知，皮膚水分含量的變化率在第4周和第6周時(shí)均為正值，且隨產(chǎn)品飲用時(shí)間增加而升高，連續(xù)飲用測(cè)試飲品6周后，受試者臉部皮膚水分含量提升了7.37%，提升顯著（p＜0.01），測(cè)試產(chǎn)品具有提升皮膚水分含量的效果。同時(shí)，利用皮膚快速成像分析系統(tǒng)Derma TOP采用條紋投影測(cè)量技術(shù)對(duì)區(qū)域眼角皺紋深度進(jìn)行測(cè)試。皺紋深度（絕對(duì)值）隨時(shí)間增加呈降低趨勢(shì)，在使用產(chǎn)品4周、6周后低于使用前，且眼角皺紋深度（絕對(duì)值）的變化率在第4周和第6周時(shí)均為負(fù)值，且在第6周達(dá)到-1.96%。由表1及圖5 C、5F可知，連續(xù)使用測(cè)試產(chǎn)品6周后，受試者眼角皺紋深度改善了1.96%（絕對(duì)值），表明該飲品具有淡化眼角皮膚細(xì)紋的效果。

2.2.2 皮膚色度及光澤度變化

人的膚色主要由褐色的黑色素、紅色氧合血紅蛋白、藍(lán)色的還原血紅蛋白及黃色的胡蘿卜素與膽色素構(gòu)成，同時(shí)也受到皮膚粗糙度、水合程度等因素的綜合影響。目前常用分析皮膚色度的CIE-LAB系統(tǒng)中，明度L*代表灰階，主要受黑色素含量影響，其值與皮膚“亮白”呈正相關(guān)；色度b*值反映皮膚的黃色程度，也與皮膚黑素含量和“暗黃”程度呈正相關(guān)。使用紅藜-蕎麥提取物飲品前后，測(cè)試區(qū)域皮膚顏色明度L*值、色度b*值變化對(duì)比見表2及圖6。

表2 使用紅藜-蕎麥提取物飲品前后皮膚顏色L*值、b*值對(duì)比Table 2 Comparison of skin color L*values and b*value before and after using Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts

圖6 受試者使用紅藜-蕎麥提取物飲品前后面部皮膚L*及b*變化Fig.6 Changes in facial skin color L*values and b*value before and after the subjects used Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts

由表2及圖6 A～B可知，受試者使用產(chǎn)品后，測(cè)試區(qū)域皮膚顏色L*值隨使用時(shí)間逐漸升高，尤其在使用飲品4周、6周后高于使用前；皮膚顏色L*值的變化率在第4周和第6周時(shí)均為正值，且隨飲品使用時(shí)間增加而升高，第6周達(dá)到0.90%。說明，連續(xù)使用測(cè)試飲品6周后，受試者臉部皮膚顏色L*值提升了0.90%，測(cè)試產(chǎn)品具有提升皮膚亮度（白度）的效果。同時(shí)，由表2及圖6 C、圖6 D可知，測(cè)試區(qū)域皮膚顏色b*值隨產(chǎn)品使用時(shí)間逐漸降低，在使用飲品4周、6周后低于使用前，且存在顯著性差異（p<0.01）；皮膚顏色b*值的變化率在第4周和第6周時(shí)均為負(fù)值，且隨飲品使用時(shí)間增加而降低，第6周達(dá)到-9.08%；說明，連續(xù)使用測(cè)試飲品6周后，受試者臉部皮膚顏色b*值改善了9.08%（絕對(duì)值），改善顯著（p<0.01），測(cè)試飲品具有改善皮膚暗黃的效果。受試者使用紅藜-蕎麥提取物飲品前后，第0、4、6周測(cè)試區(qū)域皮膚光澤度變化對(duì)比見圖7。

圖7 受試者使用紅藜-蕎麥提取物飲品前后面部皮膚光澤度變化Fig.7 Changes in facial skin gloss before and after the subjects used Chenopodium formosanum-Fagopyrum esculentum Moench.extracts

皮膚的光澤度在一定程度上可以側(cè)面反映皮膚的健康狀態(tài)。通過對(duì)受試者使用飲品前后的皮膚光澤度數(shù)值進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)受試者飲用飲品后，測(cè)試區(qū)域皮膚光澤度呈升高趨勢(shì)。由圖7可知，連續(xù)使用測(cè)試產(chǎn)品6周后，受試者臉部皮膚光澤度提升了3.05%，證明測(cè)試飲品具有提升皮膚光澤度的效果。

3 討論與結(jié)論

壓力、紫外線、環(huán)境污染及不健康的生活方式等不良因素均會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生刺激并誘發(fā)組織或細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激及糖化反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚衰老[18]。糖化反應(yīng)中過量的AGEs積累會(huì)導(dǎo)致皮膚中的膠原蛋白受到攻擊和破壞，皮膚彈性下降；抑制透明質(zhì)酸的合成、降低皮膚鎖水能力；促進(jìn)皮膚細(xì)胞凋亡，加劇皮膚老化，皮膚外觀上出現(xiàn)表面不均、皺紋增多加深等[19]。此外，隨著生理年齡增加，人體代謝減緩以及常年不健康生活的方式，使得體內(nèi)糖化終產(chǎn)物量逐漸增加，細(xì)胞防御能力下降，同時(shí)伴隨著氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。AGEs的形成和積累的同時(shí)，也使得皮膚細(xì)胞屏障功能降低，對(duì)外界刺激反應(yīng)更強(qiáng)烈，從而產(chǎn)生更多的自由基。大量的自由基積累會(huì)使細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA受到進(jìn)一步的損傷。細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下，可通過自身的代謝系統(tǒng)清除過量的ROS以防止氧化損傷的發(fā)生，但AGEs超出細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)承受限度則會(huì)持續(xù)消耗已有的抗氧化成分，促進(jìn)糖化過程和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。

本試驗(yàn)所使用的紅藜-蕎麥提取物在HFF-1細(xì)胞糖化產(chǎn)物損傷模型中表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗糖化及糖化修復(fù)效果。而以紅藜-蕎麥提取物為主要原料的抗糖化飲品，通過受試者連續(xù)使用6周后，面部皮膚水分含量、皮膚光澤度及皮膚顏色L*值均有提升，皮膚顏色b*值、眼角皺紋深度也得到改善，說明該飲品不僅可提升皮膚水分含量、皮膚光澤度及皮膚亮度（白度），還具有改善臉部皮膚暗黃及淡化眼角細(xì)紋的功效。

繼抗氧化后，抗糖化已經(jīng)成為保健品行業(yè)新的關(guān)注點(diǎn)和風(fēng)口之一，在相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的熱度推動(dòng)下，還需要發(fā)掘更多的天然、健康的綠色原料。我國(guó)應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)藥食兩用類植物中擁有眾多具有優(yōu)秀功效潛力的原料資源，化妝品和保健食品行業(yè)可從中選擇具有抗氧化或減少糖化產(chǎn)物AGEs生成的植物提取物，并對(duì)其作用機(jī)理及具體功效進(jìn)行深入研究，為功效宣稱提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)和理論支持。