周滑雪 杜丹麗 葉國柳

宮頸癌(cervical cancer，CC)是最常見的女性生殖道惡性腫瘤。2018年全球女性癌癥統(tǒng)計報告顯示，每年約有569 847名新的宮頸癌患者被確診，約有311 365名女性死于宮頸癌[1]。其發(fā)病率在近10 多年來逐漸上升[2]。且近年來隨著人們生活習(xí)慣及生活方式改變，宮頸癌發(fā)病的年輕化趨勢明顯增加，嚴(yán)重危及女性生殖健康。早期疾病通?？梢酝ㄟ^手術(shù)和/或放化療治愈，預(yù)后良好[3]。對于有骨盆外病變的婦女，5年生存率僅為17%。對于復(fù)發(fā)性疾病的婦女，預(yù)后更差，5年生存率低于5%[4]。因此，尋找治療宮頸癌的新策略、有效方法和探索影響其預(yù)后的因素至關(guān)重要。

HIST1H3D基因位于6號染色體上，編碼人類H3類組蛋白變體H3.1[5]，編碼基因中沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本中沒有多聚腺苷酸尾[6]。組蛋白是參與真核細(xì)胞染色質(zhì)縮合的基本核蛋白。組蛋白有五種類型:H1/H5、H2A、H2B、H3、H4。早在1970年Turner等研究表明組蛋白參與了各種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制[7]。組蛋白通過對氨基酸的共價修飾來調(diào)控染色質(zhì)狀態(tài)，進(jìn)而進(jìn)一步調(diào)控基因表達(dá)。事實(shí)上，越來越多的證據(jù)表明組蛋白變體與癌癥生物學(xué)有關(guān)。例如，在許多不同的腫瘤類型中，特定變體的表達(dá)水平與腫瘤惡性程度相關(guān)[5]。有研究表明，組蛋白H3 mRNA在腫瘤中積累，上調(diào)組蛋白H3 mRNA表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞的增殖活性[8]。最近有研究表明不僅HIST1H3D在原發(fā)性胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，在進(jìn)展期胃癌患者骨髓中組蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)[9]。2017年Rui等研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中HIST1H3D的表達(dá)較癌旁非癌組織有所增加[6]。但關(guān)于HIST1H3D基因在宮頸癌中的表達(dá)情況尚未有文獻(xiàn)報道。

本文通過免疫組化法檢測HIST1H3D基因在宮頸癌和不同宮頸上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析HIST1H3D基因在宮頸癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理特征、盆腔轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為宮頸癌的臨床診斷、治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年02月至2013年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)過病理確診為宮頸癌的患者，篩選出病理及資料完善的標(biāo)本74例。其中年齡≤45歲26例，>45歲48例。鱗癌58例，腺癌16例。FIGO分期：ⅠA期9例，ⅠB期46例，ⅡA期19例。選取同時期經(jīng)病理確診的低級別上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)標(biāo)本20例、高級別上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)標(biāo)本20例。同期因子宮肌瘤行子宮切除術(shù),術(shù)后病理診斷為正常子宮頸組織20例 。術(shù)前均未經(jīng)過放化療。其中宮頸癌組年齡(48.34±8.08)歲，LSIL組年齡(47.40±7.92)歲，HSIL組年齡(48.4±7.41)歲，正常宮頸組(47.80±5.16)歲。四組年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.101,P=0.959>0.05,MS組間=5.852，MS組內(nèi)=57.745)。

1.2 試劑

Histone H3.1 Antibody(組蛋白H3.1抗體)來自美國R&D公司。免疫組織化學(xué)SP法試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Olympus BX-41型顯微鏡購于日本Olympus公司，Leica-RM2235型切片機(jī)購自德國。

1.4 方法

1.4.1 操作 所有病理標(biāo)本先行HE染色，病理組織形態(tài)清晰完整，均由2名病理科醫(yī)生對其組織分化類型進(jìn)行證實(shí)。免疫組化SP法，操作方法按試劑盒及相關(guān)說明方法操作。用已知的陽性切片做陽性對照，PBS代替一抗染色后的組織切片作為陰性對照。

1.4.2 結(jié)果判斷 顯微鏡下盲選5個視野(×400)，每個視野計細(xì)胞100個。按照顯色細(xì)胞之比進(jìn)行評分:陽性細(xì)胞<10%為0分，10%～25%為 1 分，26%～50%為 2 分，51%～75%為 3 分，76%～100%為 4 分。按照細(xì)胞的染色程度進(jìn)行評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計算這兩項(xiàng)指標(biāo)相加得到免疫組化評分，0～2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(2+)，≥6分為強(qiáng)陽性(3+)。本實(shí)驗(yàn)≥3分為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件，主要采用方差分析、χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIST1H3D基因在不同宮頸組織中的表達(dá)

HIST1H3D基因表達(dá)的組蛋白H3.1定位在細(xì)胞核，主要呈棕褐色，其陽性表達(dá)率在正常宮頸組織、LISL、HISL及宮頸癌組織中逐漸升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在正常宮頸組織中陽性表達(dá)2例(10.0%)。LSIL中陽性表達(dá)5例(25.0%)。HSIL中陽性表達(dá)8例(40.0%)。宮頸癌中陽性表達(dá)53例(71.6%)，見表1。

表1 組蛋白H3.1在不同宮頸組織中的表達(dá)/例

宮頸癌組織中組蛋白H3.1的陽性表達(dá)與正常宮頸組織(χ2=20.769)、LSIL(χ2=14.481)、HISL(χ2=6.911)比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

2.2 HIST1H3D基因表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)免疫組化結(jié)果分析，組蛋白H3.1表達(dá)與宮頸癌病理分化等級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其與患者年齡、病理分型、腫瘤大小無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 HIST1H3D基因表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系/例

3 討論

組蛋白是染色質(zhì)中最豐富的蛋白質(zhì)。組蛋白有五種類型:H1/H5、H2A、H2B、H3、H4。其中H2A、H2B、H3和H4為核心組蛋白，各兩分子構(gòu)成組蛋白八聚體，其外由一條0～147個堿基對組成的DNA包繞1.65圈，形成真核細(xì)胞染色質(zhì)的基本組成部分-核小體[10]。除了組蛋白H4之外，所有的核心組蛋白都有稱為組蛋白變體的非等位亞型[11]。這些組蛋白變體是調(diào)節(jié)基因組DNA轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、復(fù)制和重組的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)參與者。組蛋白變體整合到核小體中，導(dǎo)致核小體結(jié)構(gòu)的多樣性，從而導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性[12]。

組蛋白H3家族包含216個不同的成員，來自不同的物種。迄今為止在人類細(xì)胞中被確認(rèn)存在的有8個變體：H3.1、H3.2、H3.3、H3T、H3.5、H3.X、H3.Y和CENP-A，其編碼基因大多數(shù)位于6號染色體上[13]。但最近有研究發(fā)現(xiàn)了3個新的人類組蛋白H3變體，命名為H3.6、H3.7和H3.8[14]。其中H3.1、H3.2和H3.3在體細(xì)胞中較為常見。這些變體在表達(dá)、染色質(zhì)定位和修飾狀態(tài)等方面存在較大差異。因此將H3變體分為兩個亞組，它們的數(shù)量因物種而異。復(fù)制組蛋白在S期表達(dá)達(dá)到高峰，構(gòu)成S期主要的組蛋白供應(yīng)DNA復(fù)制，它們以DNA合成耦合(DSC)的方式沉積，在人類中主要為H3.1和H3.2。置換變異體通常獨(dú)立于S期表達(dá)，以一種與DNA合成無關(guān)(DSI)的方式整合，人類最典型的是為H3.3與著絲粒H3 CENP-A變體[15]。

組蛋白H3由大約136氨基酸組成[15]。組蛋白的非結(jié)構(gòu)化N端尾部由大約30個延伸到核小體外的殘基組成，由于其殘基突出核小體外這一獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得N端是非?；钴S的，尤其是組蛋白H3和H4的N端，是組蛋白翻譯后廣泛修飾的位點(diǎn)[16]。已被確定的翻譯后修飾(PTMs)包括甲基化、乙?；?、羥基異丁基化、琥珀酰化、丙二?；?、谷氨酸?；?、糖基化修飾、磷酸化和泛素化等[17]。這些修飾改變了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。例如乙?；慕M蛋白可以中和賴氨酸殘基，減少組蛋白結(jié)合DNA，使DNA處于更放松的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。但組蛋白的異常修飾可導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的改變，在癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起著重要作用[16]。

早在1970年Turner等研究表明組蛋白參與了各種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制[7]。有研究表明組蛋白H2變體γH2AX在宮頸癌和卵巢癌細(xì)胞系中過表達(dá)。H2A.Z在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌中累積。H2A.Z.1在肝細(xì)胞中過表達(dá)，且被認(rèn)為是預(yù)后不良的1個標(biāo)志。此外，組蛋白H3變體CENP-A在乳腺癌和肺癌組織中過表達(dá)[18]。2012年Rheinbay等研究表明組蛋白突變會導(dǎo)致兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[19]。2014年Dryhurs等研究表明前列腺癌與組蛋白H2A有關(guān)[20]。對于組蛋白H3，2013年Twaya等研究發(fā)現(xiàn)不僅HIST1H3D在原發(fā)性胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，在進(jìn)展期胃癌患者骨髓中組蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)[9]。2017年Rui等采用免疫組織化學(xué)和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)肺癌組織中HIST1H3D的表達(dá)較癌旁非癌組織有所增加，且通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行分析，闡明HIST1H3D對細(xì)胞生長調(diào)控作用的基礎(chǔ)機(jī)制。其發(fā)現(xiàn)將調(diào)HIST1H3D可誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯，這表明它是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程來促進(jìn)人類肺癌細(xì)胞增殖和集落形成[6]。

本研究通過免疫組化檢測HIST1H3D基因在不同宮頸上皮內(nèi)病變組織和宮頸癌組織中的表達(dá)情況。最終發(fā)現(xiàn)HIST1H3D基因表達(dá)的組蛋白H3.1定位在細(xì)胞核，主要呈棕褐色，其陽性表達(dá)率在正常宮頸組織、LISL、HISL及宮頸癌組織中逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示組蛋白H3.1可能參與了宮頸癌及其癌前病變發(fā)生發(fā)展的全過程，在宮頸病變的早期已有組蛋白H3.1的過表達(dá)。HIST1H3D基因的表達(dá)與宮頸癌的組織病理學(xué)分化程度有關(guān)，病理分級越高表達(dá)越高。且隨著臨床分期越晚，其陽性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的組蛋白H3.1的表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，說明該基因在宮頸癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，此結(jié)果與Rui等研究肺癌中組蛋白H3.1的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)的研究結(jié)果一致[6]。本研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3.1的表達(dá)與年齡、病理類型、腫瘤大小無關(guān)。

綜上所述，宮頸癌組織中 HIST1H3D基因呈現(xiàn)高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為判斷宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)，未來需要進(jìn)一步地深入研究，期望HIST1H3D基因可以成為宮頸癌基因治療的有效靶點(diǎn)之一。