方詩琪，李 宇，黃東海，艾倫強(qiáng)，3，劉翠君，3，何美軍，3

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系恩施綜合試驗(yàn)站，湖北 恩施 445000；3.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心藥材分中心，湖北 恩施 445000）

湖北貝母（Fritillaria hupehensis Hsiao et k. c.Hsia）為百合科植物，又稱鄂貝、板貝、窯貝、奉貝［1］，主產(chǎn)于鄂西、湘西北及川東等地區(qū)，安徽、河南也有少量分布。湖北貝母以地下鱗莖入藥，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，常用于治療熱痰咳嗽、陰虛肺燥、痰核瘰疬、肺癰瘡毒等癥［2］。湖北貝母在《中國藥典》［3］和《中國植物志》［4］中都有收錄。湖北貝母作為鄂西南山區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱，受到了越來越多的重視［5］。

由于細(xì)菌耐藥性和抗生素失效等問題，2017 年2 月27 日，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)表了“全球優(yōu)先事項(xiàng)”：研究抗生素以及抗性細(xì)菌，以指導(dǎo)新抗生素的研究、發(fā)現(xiàn)和開發(fā)［6］。為推動湖北貝母資源利用并挖掘新的抗生素以及解決抗生素失效等臨床問題，本研究運(yùn)用湖北貝母石油醚段對10 株臨床耐藥菌進(jìn)行抗菌活性測試并探索了其抗菌機(jī)制，并在湖北貝母石油醚段的抗菌活性和機(jī)制探索的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行了化學(xué)成分的初步探索。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker maXis 高分辨飛行時間質(zhì)譜儀；Aglient Technologies 7890A/5975C GC-MS 聯(lián)用 儀；Agilent 1260 高效液相色譜儀（配DAD 檢測器），Phenomenex色譜柱（50 mm×4.6 mm，ODS 5 μm）；Agilent Poroshell反相色譜柱120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；HS-GF254 硅膠薄層板；J&K 色譜純乙腈。

所有臨床致病菌經(jīng)中國科學(xué)院南海海洋研究所中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定。所用湖北貝母樣品是采集于湖北省恩施市的人工種植品，經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所由金文副研究員鑒定為湖北貝母鱗莖。

1.2 方法

1.2.1 湖北貝母石油醚段抗菌活性測試 409.8 g干燥湖北貝母磨成粉，加入60% 乙醇溶液2 L，冷浸24 h，200 W 超聲提取30 min，過濾，濾液減壓濃縮回收溶劑。浸膏用石油醚萃取3 次，每次2 L，分液，合并石油醚層，減壓濃縮回收石油醚，得到石油醚段浸膏0.527 4 g。DMSO 溶解得到的石油醚組分浸膏（0.174 1 g/mL），用于后續(xù)致病菌相關(guān)試驗(yàn)。

采用濾紙片法［7］測定湖北貝母石油醚段對10株臨床耐藥菌的抑菌活性。DMSO 溶解湖北貝母石油醚段，用打孔器將濾紙打成直徑6 mm 的圓片，滅菌后在培養(yǎng)箱中烘干。取100 μL 培養(yǎng)至OD600nm為0.6 的測試菌菌液與20 mL LB 固體培養(yǎng)基（微波爐融化，冷卻至不燙手）混合均勻倒平板。將濾紙片置于混有菌液的培養(yǎng)基上，取5 μL 湖北貝母石油醚段（DMSO 溶液溶解）于濾紙片上，使濾紙片完全吸收。根據(jù)藥理學(xué)試驗(yàn)方法判斷：抑菌圈＜10 mm 為耐藥和無抑菌作用；10 mm 為輕度敏感；11～15 mm 為中度敏感；—16 mm 為高度敏感?？股氐囊志σ耘R床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 湖北貝母石油醚段抗菌活性MIC（最低抑菌濃度）/MBC（最低殺菌濃度）測定 采用稀釋倒平板法（Pour plate method）［8］測定湖北貝母石油醚段對10 株臨床耐藥菌的MIC。用DMSO 溶液溶解湖北貝母石油醚段，加入到20 mL LB 固體培養(yǎng)基（微波爐融化，冷卻至不燙手），形成系列含有不同湖北貝母石油醚段濃度（50、20、10、5、3、2、1、0.5、0.2、0.1 mg/mL）的平板。取10 μL 培養(yǎng)至OD600nm為0.6 的測試菌菌液于試驗(yàn)平板涂板，培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)計(jì)算抑制率。

1.2.3 湖北貝母石油醚段對致病菌生長曲線影響檢測 利用超微量紫外分光光度計(jì)［9］測定湖北貝母石油醚段對3 株生長抑制最明顯的臨床耐藥菌（綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）生長的影響。接種0.5 mL 適宜濃度（約100 CFU/mL）的菌懸液至裝有50 mL LB 培養(yǎng)基3 個250 mL 錐形瓶（高壓滅菌）中，并編號為1、2、3。向1、2 號錐形瓶中分別加入使其終濃度達(dá)到1×MIC 和2×MIC，于37 ℃下150 r/min 培養(yǎng)24 h，期間每隔2 h 在無菌條件下取樣，在600 nm 波長處測定并記錄吸光度，繪制生長曲線。

1.2.4 湖北貝母石油醚段對致病菌菌液電導(dǎo)率影響檢測 利用電導(dǎo)儀［10］測定湖北貝母石油醚段對3株生長抑制最明顯的臨床耐藥菌（綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）的菌液離子濃度［10］。將生長對數(shù)期致病菌菌液用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次，菌液濃度調(diào)到108CFU/mL，取5 mL，分別加入使其終濃度達(dá)到1×MIC 的湖北貝母石油醚段，每隔10 min 測定1 次電導(dǎo)率。

1.2.5 湖北貝母石油醚段對致病菌菌液內(nèi)容物釋放檢測 利用超微量紫外分光光度計(jì)［11］測定湖北貝母石油醚段對3 株生長抑制最明顯的臨床耐藥菌（綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）的菌液中菌液內(nèi)容物釋放。將生長對數(shù)期的50 mL 致病菌菌液在4 000 r/min 離心15 min 收集菌體，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次，90 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）重懸菌體，分裝3 個100 mL 錐形瓶中，并標(biāo)記為1、2、3 號，向1、2 號錐形瓶中分別加入湖北貝母石油醚段，使其終濃度達(dá)到1×MIC，以加有等體積DMSO 的3 號菌懸液為對照，將各錐形瓶置于37 ℃下150 r/min 培養(yǎng)6 h，期間每隔2 h在無菌條件下取樣，菌懸液在8 000 r/min 離心5 min，取上清液在260 nm 波長處測定其吸光度以反映菌懸液中核酸等內(nèi)容物含量。

1.2.6 湖北貝母石油醚段化合物GC-MS 分析 氣相色譜條件：agilent 19091S-433 毛細(xì)管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）；升溫程序：60 ℃保持2 min，5 ℃/min 升至240 ℃，保持2 min，然后10 ℃/min 升至280 ℃，保持2 min，總運(yùn)行時間23 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為高純度氦氣（99.999%）；流速為1.8 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 amu，檢索譜庫為NIST08.LIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫。

1.2.7 湖北貝母石油醚段化合物分離鑒定 稱取干燥湖北貝母鱗莖20 kg，粉碎，過40 目篩，共用40 L的60% 乙醇溶液萃取，采用60% 乙醇溶液100 L 冷浸提取96 h，過濾，減壓濃縮回收乙醇，得到浸膏800.27 g。浸膏加1 L 水懸浮，再加3 倍體積的石油醚萃取3 次，分液，合并石油醚相，減壓回收石油醚，得到貝母石油醚段浸膏80.2 g。

湖北貝母石油醚段浸膏采用硅藻土拌樣，硅膠柱層析（Φ10 cm×50 cm）分離，以石油醚/乙酸乙酯體系（100∶0、80∶20、50∶50、20∶80、0∶100，V/V）洗脫，得到8 個組分Fr.A1 至Fr.A8。根據(jù)HPLC 和TLC 分析結(jié)果，將Fr.A4 至Fr.A6 合并正向硅膠分離，以石油醚/氯仿體系（100∶0、98∶2、96∶4、94∶6、92∶8、90∶10、80∶20，V/V，下同）洗脫，得到10 個組分Fr.B1至Fr.B10。根據(jù)HPLC 分析，經(jīng)半制備HPLC、ODS色 譜 柱（250 mm×10 mm，5 μm）分 離Fr. B5，以CH3CN/H2O（90∶10 至100∶0）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物1（tR 21.7 min，4 mg）。組分Fr.B6 至Fr.B7 合并，經(jīng)半制備HPLC、ODS 色譜柱分離，以CH3CN/H2O（85∶15）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物3（tR 24.5 min，10 mg）。組分Fr.B8 走凝膠柱，以丙酮洗脫，得到化合物2（100 mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖北貝母石油醚段的抗菌活性

湖北貝母石油醚段浸膏為0.527 4 g，浸膏得率為0.129%。湖北貝母石油醚段對蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌有中度敏感抑制活性（抑菌圈為11～15 mm），對肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽孢桿菌有輕度敏感抑制活性（抑菌圈—10 mm）。

表1 湖北貝母石油醚段的抗菌活性

2.2 湖北貝母石油醚段抗菌活性MIC 和MBC

基于湖北貝母石油醚段對于蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽孢桿菌有中度或輕度敏感抑制活性，本研究進(jìn)一步考察其對應(yīng)的MIC 和MBC［12］。如果MBC/MIC＞4，則認(rèn)為抗生素具有抑菌作用；如果MBC/MIC＜4，則認(rèn)為具有殺菌作用［13］。湖北貝母石油醚段對3 株致病菌：蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的MBC/MIC 均小于4.0，且其MIC 都在2 mg/mL 以下；對肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213 的MBC/MIC 大于4.0。

表2 湖北貝母石油醚段的抗菌MIC 和MBC

2.3 湖北貝母石油醚段對致病菌生長的影響

基于湖北貝母石油醚段對3 株致病菌：蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的MBC/MIC 小于4.0，且其MIC 都在2 mg/mL 以下，本試驗(yàn)探究了湖北貝母石油醚段對這3 株致病菌生長過程的影響。生長曲線測定結(jié)果顯示湖北貝母石油醚段對綠膿桿菌（圖1A）、蘇云金芽孢桿菌（圖1B）、枯草芽孢桿菌（圖1C）相對于各自細(xì)菌的對照組（DMSO）均有顯著的抑制生長作用，試驗(yàn)組生長緩慢。隨著處理濃度由1/2×MIC 升為1×MIC 時，菌體的生長進(jìn)一步變緩。但湖北貝母石油醚段對3 種菌的抑制模式不盡相同，對于綠膿桿菌（圖1A）、蘇云金芽孢桿菌（圖1B），在藥物的作用下遲緩期明顯增長，對數(shù)期的斜率變緩，從而達(dá)到抑制生長的結(jié)果；而對于枯草芽孢桿菌（圖1C），藥物沒有將細(xì)菌大幅度阻遏在遲緩期，主要通過減緩對數(shù)期的斜率達(dá)到抑制生長。相較枯草芽孢桿菌（圖1C）主要抑制對數(shù)期而言，湖北貝母石油醚段對于綠膿桿菌（圖1A）、蘇云金芽孢桿菌（圖1B）抑制模式的抑制力度更大，這與前述抑菌圈試驗(yàn)以及MBC/MIC 的結(jié)果相互佐證。

圖1 湖北貝母石油醚段對細(xì)菌生長曲線的影響

2.4 湖北貝母石油醚段對細(xì)菌膜通透性的影響

致病菌菌液電導(dǎo)率測定結(jié)果（圖2）顯示，湖北貝母石油醚段使得綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液的離子濃度先降低，再緩慢上升。推測其可能的機(jī)制是湖北貝母石油醚段中酚酸類有機(jī)酸根離子先結(jié)合到細(xì)胞膜表面，使得菌液離子濃度和電導(dǎo)率下降。有機(jī)酚酸根離子先結(jié)合到細(xì)胞膜表面后，與細(xì)胞膜前期靜電相互作用，逐漸造成膜破壞、細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)鉀離子、鈉離子、氫離子、核酸等帶電離子滲漏，從而抑制細(xì)菌生長，這與文獻(xiàn)［14］報道基本一致。

2.5 湖北貝母石油醚段對菌懸液中大分子內(nèi)容物含量的影響

超微量紫外分光光度計(jì)測定結(jié)果（圖3）顯示，湖北貝母石油醚段使得綠膿桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液中核酸濃度隨時間上升。推測其可能的機(jī)制是湖北貝母石油醚段中的酚酸類有機(jī)酸根離子先結(jié)合到細(xì)胞膜表面后，與細(xì)胞膜前期靜電相互作用，逐漸造成膜破壞、細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)大分子核酸、蛋白質(zhì)等滲漏，從而抑制細(xì)菌生長，這與文獻(xiàn)［15］報道基本一致。

圖2 湖北貝母石油醚段對致病菌菌液電導(dǎo)率的影響

圖3 湖北貝母石油醚段對菌懸液中核酸類物質(zhì)含量的影響

2.6 湖北貝母石油醚段化合物分離鑒定

湖北貝母石油醚段揮發(fā)油用丙酮稀釋，得到了湖北貝母石油醚段GC-MS 總離子流，并根據(jù)保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST08.LIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行了比對，得到了對應(yīng)的27 種化合物（圖4）。從表3 可以看出，GC-MS 成分中含有較多的脂肪酸類化合物和甾醇類化合物，對湖北貝母石油醚段化合物的分離鑒定提供了指導(dǎo)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)湖北貝母石油醚段對蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌有中度敏感抑制活性，對肺炎克雷伯桿菌ATCC13883、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽孢桿菌有輕度敏感抑制活性。通過抗菌機(jī)制探索，湖北貝母石油醚段很可能通過破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)K＋、Na＋、H＋等帶電離子滲漏以及一些大分子胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，從而減緩了蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌生長，達(dá)到抗菌的效果。由于湖北貝母石油醚段有抗菌活性，本研究進(jìn)而對湖北貝母石油醚段成分進(jìn)行了探索，獲得了湖北貝母石油醚段GC-MS 總離子流，并根據(jù)保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST08.LIB 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行了比對，得到了對應(yīng)總離子流中27 種化合物。湖北貝母石油醚段的優(yōu)良抗菌活性和抗菌廣譜性為研發(fā)優(yōu)質(zhì)植物來源的天然抗生素提供了基礎(chǔ)。

表3 湖北貝母石油醚段主要成分

圖4 湖北貝母石油醚段GC-MS 總離子流