周佳偉，吳俊靜，喬 木，王孝忠，劉貴生，梅書(shū)棋，彭先文

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.湖北省宜昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 宜昌 443000）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種真菌毒素，具有類雌激素作用，能夠與雌激素受體α 和雌激素受體β 結(jié)合，導(dǎo)致雌激素水平失調(diào)，影響動(dòng)物生殖［1］。卵泡內(nèi)包括卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和壁細(xì)胞，雌激素主要由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，雌激素/孕酮的比例直接影響卵泡的發(fā)育，當(dāng)雌激素/孕酮比例過(guò)低會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡，引發(fā)卵泡閉鎖［2］。研究表明，ZEA 會(huì)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡、阻礙卵母細(xì)胞的成熟并提高細(xì)胞內(nèi)的活性氧的水平［3-5］。

褪黑素（Melatonin，MT）主要是由哺乳動(dòng)物下丘腦松果體產(chǎn)生的一種吲哚胺類激素，已被報(bào)道與卵泡發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)［6］。Liu 等［7］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅提高豬卵巢顆粒細(xì)胞中雌激素的含量，且可以調(diào)控與細(xì)胞增殖及凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)水平。Wang 等［8］發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)褪黑素受體上調(diào)BCL2、BCL-XL、GPX4 和SOD1 的表達(dá)和下調(diào)BAX、CASP3 和TP53 的表達(dá)來(lái)抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。在氧化應(yīng)激條件下，褪黑素通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制FOXO1 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性以及介導(dǎo)SIRT信號(hào)通路提高FOXO1 蛋白的去乙?；?，從而提高小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的抗氧化能力并抑制細(xì)胞自噬［9］。

本研究從3～5 mm 的卵泡中抽取卵泡液，分離豬卵巢顆粒細(xì)胞，通過(guò)添加不同濃度的ZEA 探究其對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步通過(guò)加入不同濃度的褪黑素來(lái)檢測(cè)褪黑素能否抑制ZEA 對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

從武漢市某生豬屠宰場(chǎng)采集豬卵巢組織，用37 ℃含1% 雙抗（鏈霉素和青霉素）的PBS 溶液清洗3 次，用1 mL 注射器扎破直徑3～5 mm 的卵泡，抽取卵泡液，靜置2 min；將收集好的卵泡液依次使用100 μm 和70 μm 的細(xì)胞篩過(guò)濾，將過(guò)濾后的卵泡液1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入含1% 雙抗無(wú)血清DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)3 次；加入含1% 雙抗和10%FBS 的DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基，放置在37 ℃下5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分離24 h 后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，48 h 后便可將豬卵巢顆粒細(xì)胞接種，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)

分離豬卵巢顆粒細(xì)胞，接種到6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)/mL 時(shí)，分別使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA 處理細(xì)胞，24 h 后每孔加入400 μL 不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，用含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化并收集細(xì)胞；用PBS 溶液洗滌細(xì)胞2 次，2 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞；加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，再加入5 μL Propidium Iodidie，混勻；室溫、避光、靜置15 min；上機(jī)檢測(cè)。

1.3 豬卵巢顆粒細(xì)胞的活力檢測(cè)

分離豬卵巢顆粒細(xì)胞，將其接種到96 孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)/mL 時(shí)，分別使用0、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，24 h 換液，PBS 溶液洗滌2 次后更換30 μmol/L 的ZEA 處理豬卵巢顆粒細(xì)胞，ZEA 處理后24 h，每孔加入10 μL CCK8 試劑，并將細(xì)胞繼續(xù)放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEA 顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡

采集母豬卵巢，從3～5 mm 的卵泡中抽取卵泡液，分離豬卵巢顆粒細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)/mL時(shí)，分別使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA處理細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比例（圖1）。3 和10 μmol/L 的ZEA 對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響不顯著，而30、50 和100 μmol/L 均顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，且隨著ZEA 濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸提高。ZEA 可顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖1 ZEA 促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡

2.2 褪黑素抑制ZEA 誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡

細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累是ZEA 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，而MT 作為一種廣譜抗氧化劑，能夠有效減少由氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞凋亡。本研究中檢測(cè)MT 能否抑制ZEA 引發(fā)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，將MT 加入到DMEM/F12 培養(yǎng)基中，稀釋成含有0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的無(wú)血清培養(yǎng)基，分別用其處理豬卵巢顆粒細(xì)胞，24 h 后更換30 μmol/L 的ZEA 處理豬卵巢顆粒細(xì)胞，ZEA 處理后24 h。如圖2 所示，0.1 和1 μmol/L 的MT 均能夠顯著抑制ZEA 引起的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，且0.1和1 μmol/L 的MT 均能顯著提高細(xì)胞的活力。適宜濃度的MT 可以作為一種保護(hù)劑抑制ZEA 引起的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。

3 討論

ZEA 是豬場(chǎng)飼料的主要污染物之一，母豬過(guò)量食入會(huì)攻擊生殖系統(tǒng)，其以卵巢顆粒細(xì)胞為主要靶點(diǎn)，影響卵泡發(fā)育，降低母豬產(chǎn)仔數(shù)。Zhang 等［10］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)ZEA 可通過(guò)調(diào)節(jié)lncRNA 的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK1、CCNB1、CDC25A 和CDC25C 的表達(dá)，導(dǎo)致豬卵巢顆粒細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期。并且ZEA 也可通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)miR-744、miR-1343 和miR-331-3p的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。本研究通過(guò)使用不同濃度ZEA 處理豬卵巢顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)30、50 和100 μmol/L 的ZEA 顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖2 MT 抑制ZEA 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

目前，針對(duì)ZEA 誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)性化合物的研究較少。Lai 等［12］研究發(fā)現(xiàn)在卵泡生長(zhǎng)液或卵母細(xì)胞成熟液中添加溶血磷脂酰膽堿可部分保護(hù)ZEA 對(duì)卵泡腔形成和卵母細(xì)胞成熟的影響。另有研究檢測(cè)了20 種中藥提取物對(duì)ZEA 所誘導(dǎo)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，表明綠原酸可顯著抑制ZEA 誘導(dǎo)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡［13］。由于ZEA 可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累，而MT是一種廣譜的細(xì)胞抗氧化劑，因此，本研究檢測(cè)MT是否保護(hù)ZEA 誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1 和1 μmol/L 的MT 抑制30 μmol/L 的ZEA對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，提高細(xì)胞的活力。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZEA 促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，而MT 可抑制ZEA 誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中MT 可用來(lái)預(yù)防ZEA 引起的母豬繁殖性能降低。