廖華媛，熊夢(mèng)霞，李潤(rùn)成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

孔雀石綠（Malachite green；MG）是一種三苯甲烷染料，被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，同時(shí)還被作為抗菌劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，直到1993 年被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）列為致癌性化學(xué)物［1，2］。但由于MG 的低成本和高效性［3］，其仍被非法使用，并在魚(yú)組織和養(yǎng)殖用水中檢測(cè)到有MG 殘留［4，5］。此外，MG 擁有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的孔雀石綠，其在環(huán)境中降解周期長(zhǎng)，難以根除［6］。因此，如何安全有效地降解環(huán)境中的孔雀石綠成為亟待解決的難題。

一些物理化學(xué)技術(shù)，如吸附、氧化（過(guò)氧化氫、臭氧）、電化學(xué)處理已用于去除廢水中的孔雀石綠并取得一定的效果，但存在成本高、效率較低或產(chǎn)生二次污染等問(wèn)題［7］。而微生物法是目前最安全、有效及普遍的使用方法［8］。目前已報(bào)道的能降解孔雀石綠的細(xì)菌主要有氣單胞菌屬［9］、假單胞菌屬［10］、腸桿菌屬［11，12］及芽孢桿菌屬［13］等。本研究以孔雀石綠為目標(biāo)染料，對(duì)11 株不同種的土壤分離菌進(jìn)行篩選，結(jié)果得到了1 株能有效降解高濃度孔雀石綠的菌株，并對(duì)其脫色性能及孔雀石綠經(jīng)其降解后對(duì)細(xì)菌的毒性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 11 株土壤分離菌均源自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病分子與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。菌株編號(hào)及各菌株的16S 測(cè)序鑒定情況見(jiàn)表1。

表1 11 株不同種土壤分離菌信息

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L；LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L。

1.1.3 主要試劑及儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海經(jīng)鴻實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；全溫度光照振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司生產(chǎn)；連續(xù)酶標(biāo)波長(zhǎng)儀SpectraMax M5，美國(guó)Molecular Devices 公司生產(chǎn)；孔雀石綠［（C23H25N2）2·2H2C2O4，相對(duì)分子質(zhì)量926.98］為化學(xué)純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 將11 株菌株按1% 接種到3 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，將各菌培養(yǎng)液按OD600nm調(diào)至相同濃度后，各取3 μL 滴在含300 mg/L 孔雀石綠的LB 平板中央，放入37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h。能使含MG 的LB 瓊脂顏色消失或變淡的菌株被認(rèn)為其對(duì)孔雀石綠有脫色降解作用［14，15］，并作為下一步研究的目標(biāo)菌株。

1.2.2 目標(biāo)菌株對(duì)孔雀石綠脫色降解效能的測(cè)定用500 mL 的錐形瓶配制100 mL 分別含300、400、500、600、700、800、900、1 100、1 300 mg/L 孔雀石綠的LB 培養(yǎng)基（pH 7），在染料培養(yǎng)基中按1%（V/V）接種量接入菌株S1-2，于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，每隔12 h 取500 μL 離心，取上清200 μL 測(cè)定OD622nm。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長(zhǎng)是否被抑制。

1.2.3 脫色降解處理后MG 溶液對(duì)細(xì)菌毒性的檢測(cè) 降解處理后MG 溶液對(duì)細(xì)菌毒性檢測(cè)采用牛津杯法［16］。以在含MG 的LB 平板中不生長(zhǎng)的菌株S2-4（解淀粉芽孢桿菌）、A15（壁芽孢桿菌）作為受試菌種。所用細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)12 h，復(fù)蘇后，每個(gè)菌株取100 μL 分別涂布至牛津杯中含100 μL 300 mg/L MG 的LB 平板，及牛津杯中含100 μL 降解處理后MG（試驗(yàn)“1.2.2”中300 mg/L MG 經(jīng)處理后的產(chǎn)物，離心取上清液并過(guò)濾除菌）的LB 平板，每個(gè)處理1 次重復(fù)。各接種物37 ℃培養(yǎng)10 h 后測(cè)定抑菌圈的直徑（抑菌圈直徑-牛津杯直徑），脫色降解前后孔雀石綠對(duì)細(xì)菌的毒性通過(guò)抑菌圈的直徑大小反映。

式中，Db為孔雀石綠降解前抑菌圈的直徑；Da為孔雀石綠降解后抑菌圈的直徑。

1.2.4 目標(biāo)菌株發(fā)揮脫色降解MG 作用的條件分析

1）種子菌液的培養(yǎng)。將對(duì)MG 具有脫色降解作用的菌株接種于含10 mL LB 液體培養(yǎng)基（pH 7）的50 mL 離心管中，于37 ℃、180 r/min 條件下，培養(yǎng)至OD600nm為0.80～0.90 作為種子菌液。

2）不同接菌量對(duì)菌株脫色降解MG 作用的影響。 在10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培養(yǎng)基（pH 7.0）中按0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0% 接菌，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)9 h 后，每隔2 h 取500 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心（8 000 r/min、5 min），取200 μL 上清液，測(cè)定OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測(cè)定。

3）初始培養(yǎng)液pH 對(duì)菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響。用HCl 和NaOH 將10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培養(yǎng)基的初始pH 分別調(diào)為3、4、5、6、7，按1%（V/V）接入目標(biāo)菌株，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)9 h后，每隔2 h 取500 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心，再每孔取200 μL 上清液，測(cè)定OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測(cè)定。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長(zhǎng)是否被抑制。

4）培養(yǎng)溫度對(duì)菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響。在10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培養(yǎng)基（pH 7）中按1%（V/V）接種量接入目標(biāo)菌株，分別放置在20、25、30、35、40 ℃，180 r/min 培養(yǎng)9 h 后，每隔2 h取500 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心，取200 μL 上清液測(cè)OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測(cè)定。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長(zhǎng)是否被抑制。

5）鹽濃度對(duì)菌株產(chǎn)生脫色降解MG 作用的影響。在10 mL 分別含NaCl 濃度為6、8、10、12、14、16、18 g/L MG（300 mg/L）的LB 培養(yǎng)基中，按1%（V/V）接種目標(biāo)菌株，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)9 h 后，每隔2 h取200 μL 培養(yǎng)物進(jìn)行離心，測(cè)定OD622nm，直至培養(yǎng)23 h 結(jié)束測(cè)定。不發(fā)生脫色反應(yīng)則取培養(yǎng)液接種，考察細(xì)菌生長(zhǎng)是否被抑制。

6）孔雀石綠脫色降解率的計(jì)算。參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行孔雀石綠脫色降解率的計(jì)算，取培養(yǎng)液以8 000 r/min 離心5 min，在孔雀石綠最大吸收波長(zhǎng)622 nm處測(cè)定上清液的吸光度，以相同MG 濃度不接菌的溶液作為對(duì)照，取2 個(gè)平行處理的平均值計(jì)算脫色率。以脫色率來(lái)表示菌株對(duì)孔雀石綠的脫色能力。

式中，A0表示不接菌溶液的吸光度；At表示接菌培養(yǎng)t 時(shí)間后溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 和GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

11 株土壤分離菌在含MG（300 mg/L）的LB 平板中37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h 后觀察，結(jié)果（圖1）表明，陰溝腸桿菌（S1-2）、銅綠假單胞菌（6-1）菌苔周圍MG 脫色明顯，但菌株S1-2 脫色面積更大，因此，確定S1-2 為下一步研究的目標(biāo)菌株。此外，菌株S2-4、A15 在平板中不生長(zhǎng)，因此將這2 株菌作為脫色降解處理后MG 溶液對(duì)細(xì)菌毒性檢測(cè)的受試微生物。

圖1 菌株S1-2、6-1 在孔雀石綠LB 平板中的脫色分解情況

2.2 目標(biāo)菌株對(duì)孔雀石綠脫色降解效能的測(cè)定

配制MG 初始質(zhì)量濃度300～1 300 mg/L LB 培養(yǎng)基以測(cè)定目標(biāo)菌株對(duì)MG 的降解效能，各濃度MG 降解結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。由表2 可見(jiàn)，菌株S1-2在12 h 內(nèi)對(duì)300 mg/L MG 的脫色率為94.19%；在24 h 內(nèi)對(duì)400～900 mg/L MG 的脫色率為95.95%～96.80%；36 h 內(nèi) 對(duì)1 100 mg/L MG 的 脫 色 率 為96.72%；菌株S1-2 培養(yǎng)至48 h 對(duì)1 300 mg/L MG仍無(wú)脫色，結(jié)果取10 μL 該組培養(yǎng)液涂布在普通LB平板中，只有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制。

表2 菌株S1-2 對(duì)MG 的脫色率 （單位：%）

圖2 菌株S1-2 降解MG 的顏色變化過(guò)程

2.3 孔雀石綠經(jīng)S1-2 菌株脫色后對(duì)細(xì)菌毒性的檢測(cè)

以在含MG 的LB 平板中不生長(zhǎng)的菌株S2-4（解淀粉芽孢桿菌）、A15（壁芽孢桿菌）為受試微生物，抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3 和圖3。由表3 可知，在牛津杯中加入100 μL MG（300 mg/L），對(duì)菌株S2-4、A15 的抑菌圈直徑分別為（22.40±5.00）mm、（21.60±2.20）mm；在牛津杯中加入100 μL 處理后，MG（降解前濃度為300 mg/L）的抑菌圈分別為（10.80±1.90） mm、（9.50±2.00） mm；毒 性 分 別 降 低 了48.21%、43.98%。結(jié)果表明，孔雀石綠經(jīng)菌株S1-2脫色降解處理后，毒性有一定程度的降低。

表3 孔雀石綠脫色后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用

圖3 孔雀石綠脫色前后對(duì)細(xì)菌的毒性測(cè)試結(jié)果

2.4 目標(biāo)菌株發(fā)揮脫色降解MG 作用的條件分析

2.4.1 不同接菌量對(duì)菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響 接菌量（0.5%～7.0%）對(duì)MG 脫色降解的影響見(jiàn)圖4。由圖4 可知，培養(yǎng)9～15 h，接種量對(duì)孔雀石綠脫色的影響較明顯，即接種量與降解率呈負(fù)相關(guān)。9～15 h 內(nèi)，同等培養(yǎng)時(shí)間下，0.5% 接種量的降解體系脫色率最高，達(dá)59.9%～83.89%；培養(yǎng)23 h 后，各接種量的脫色率接近一致，為91.67%～93.91%。

圖4 不同接種量對(duì)菌株S1-2 脫色的影響

2.4.2 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)生MG 脫色降解作用的影響 將菌株在pH 3～7、含MG 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，pH 對(duì)菌株發(fā)揮MG 脫色降解作用的影響見(jiàn)圖5。培養(yǎng)基初始pH 為3～5 時(shí)，菌株未能產(chǎn)生脫色作用，取10 μL 培養(yǎng)液涂布在普通LB 平板中，結(jié)果僅少量細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制；當(dāng)pH為6、7 時(shí)，培養(yǎng)23 h 后，菌株對(duì)孔雀石綠的脫色率分別為90.02%、94.54%。綜上所述，菌株S1-2 不耐酸，僅在pH 為6、7 時(shí)才能發(fā)揮MG 脫色降解作用。

圖5 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株S1-2 脫色的影響

2.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)生脫色降解MG 作用的影響 溫度能影響細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝，從而影響菌株脫色降解MG 的效率。溫度（20～40 ℃）對(duì)菌株S1-2脫色的影響見(jiàn)圖6。 由圖6 可知，當(dāng)溫度為20～35 ℃，培養(yǎng)9～17 h，脫色率隨著溫度的升高而增大，同等培養(yǎng)時(shí)間下，35 ℃時(shí)脫色率達(dá)到最高，為71.26%～92.01%；當(dāng)溫度為40 ℃，培養(yǎng)9～13 h 時(shí)，脫色率在同等培養(yǎng)時(shí)間下較20～35 ℃低，為35.41%～40.05%。脫色體系在20～40 ℃培養(yǎng)23 h 后脫色率為84.61%～94.56%，說(shuō)明該菌能在較大溫度范圍內(nèi)脫色降解MG。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株S1-2 脫色的影響

2.4.4 鹽濃度對(duì)菌株脫色降解MG 的影響 鹽濃度（6～18 g/L）對(duì)菌株脫色的影響見(jiàn)圖7。由圖7 可知，MG 降解體系培養(yǎng)19 h，鹽濃度對(duì)孔雀石綠降解有明顯影響，鹽濃度與脫色率呈負(fù)相關(guān)，鹽濃度為6～8 g/L 時(shí)，脫色效果最明顯；培養(yǎng)至23 h 時(shí)，各鹽濃度的脫色率接近一致，為91.85%～93.77%，說(shuō)明該菌具有一定的耐鹽能力。

圖7 鹽濃度對(duì)菌株S1-2 脫色的影響

3 小結(jié)與討論

孔雀石綠作為三苯甲烷染料之一，具有高毒、高殘留、致癌和致突變等毒性作用［19］。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)技術(shù)是處理環(huán)境中孔雀石綠的有效方法之一。本研究中篩選得到的陰溝腸桿菌對(duì)高濃度孔雀石綠有較強(qiáng)的脫色分解能力，36 h 內(nèi)完全降解1 100 mg/L MG。Du 等［8］在活性污泥中分離到一株假單胞菌屬YB2，在最適pH 及溫度下，24 h 內(nèi)對(duì)1 500 mg/L 孔雀石綠的分解率為90.40%，12 h 內(nèi)能完全分解1 000 mg/L 孔雀石綠；Lv 等［17］研究表明，耐輻射球菌R1 能在30 min 中降解97.2% 的200 mg/L MG，但菌株的接種量較大（濕重菌接種量為8.0 g/L），通過(guò)比較說(shuō)明本次篩選得到的菌株S1-2 能降解較高濃度的孔雀石綠。當(dāng)MG 濃度達(dá)1 300 mg/L 時(shí)細(xì)菌被抑制生長(zhǎng)，可能是由于MG 本身作為一種抗菌劑，對(duì)菌株具有毒性，濃度越高對(duì)細(xì)菌的毒害越大。

MG 脫色降解前后對(duì)菌株解淀粉芽孢桿菌、壁芽孢桿菌的毒性測(cè)試結(jié)果表明，經(jīng)降解后的MG 對(duì)敏感菌抑制率降低了43.98%～48.21%。說(shuō)明菌株陰溝腸桿菌降解孔雀石綠后，脫色降解產(chǎn)物的毒性在一定程度上有所降低［20，21］。

目標(biāo)菌株產(chǎn)生脫色降解MG 的作用條件分析發(fā)現(xiàn)，菌株陰溝腸桿菌接菌量在0.5%～7.0%，接種量與MG 降解率呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)當(dāng)接種量為0.5%～7.0%時(shí)，接種量越小，單個(gè)細(xì)菌可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越多，細(xì)菌繁殖、代謝相對(duì)更旺盛，繁殖的代數(shù)也更多，因此低接種量的降解體系在短時(shí)間內(nèi)的MG 降解率較高。

pH 可以通過(guò)改變微生物表面的電荷影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也可通過(guò)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響蛋白功能的發(fā)揮［22］，且文獻(xiàn)［23，24］報(bào)道MG 在堿性環(huán)境中易發(fā)生沉淀而退色，本研究預(yù)試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，pH 為10、11 時(shí)，MG 可自動(dòng)出現(xiàn)明顯脫色，因此在研究培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株脫色降解MG 影響時(shí)只設(shè)置了pH 3～7。結(jié)果證明菌株陰溝腸桿菌在pH 3～5 生長(zhǎng)受到抑制，在pH 6、7 條件下，培養(yǎng)23 h能脫色降解90.02%～94.54% 的300 mg/L MG，說(shuō)明該菌不耐酸。

菌株陰溝腸桿菌在20～40 ℃培養(yǎng)23 h，對(duì)MG脫色率在84.61% 以上。 文獻(xiàn)［12］中Enterobacter sp. B-20 在25～40 ℃對(duì)MG 降解率在75% 以上，而菌株陰溝腸桿菌同為腸桿菌屬，MG 降解體系在20～40 ℃的降解率達(dá)84.61% 以上，相比之下菌株陰溝腸桿菌發(fā)揮作用的溫度范圍更大，說(shuō)明該菌在溫度跨度較大范圍內(nèi)同樣具有對(duì)孔雀石綠脫色降解的能力。

氯化鈉在染織過(guò)程中提供的離子作用力能將染料印在待染色的織物上，同時(shí)也能將未與織物結(jié)合的染料釋放到廢水中。菌株陰溝腸桿菌在6～18 g/L NaCl 環(huán)境中，培養(yǎng)23 h 后脫色降解率達(dá)91.85%～93.77%。說(shuō)明該菌具有一定的耐鹽能力，而對(duì)鹽具有一定耐受的菌株在處理染料廢水過(guò)程中具有重要作用。

綜上所述，陰溝腸桿菌能脫色降解較高濃度MG，對(duì)鹽濃度有一定的耐受性且作用溫度范圍較廣，具有修復(fù)染料廢水的應(yīng)用前景。