（溫氏食品集團(tuán)股份有限公司/國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東云浮 527400）

1971年，豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）在英國(guó)被首次發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳至西班牙等其他歐洲國(guó)家[1]；1982年，日本發(fā)現(xiàn)PED，隨后在中國(guó)、韓國(guó)等亞洲國(guó)家相繼有PED流行的報(bào)道[2]；2010年，我國(guó)暴發(fā)PED，該病的廣泛傳播給我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]；2013年，美國(guó)首次暴發(fā)PED，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該毒株與中國(guó)分離的AH2012毒株同源性高達(dá)97%～99%。如今，PED已經(jīng)成為一種世界范圍內(nèi)的流行病。感染豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的哺乳仔豬及保育豬死亡率極高，因此研究PEDV的病原學(xué)、病毒基因組特性、感染機(jī)制等，為預(yù)防PED以及疫苗研發(fā)提供新的思路與參考。

1 病原學(xué)

1.1 病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)

PEDV為尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronaviridae）成員[4]。PEDV有囊膜，囊膜表面有18～23 nm纖突，呈花瓣?duì)睿珊诵南蛩闹艹史派錉罘植?，纖突末端呈球狀；該病毒直徑約為95～190 nm，為單股正鏈、不分節(jié)段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb，編碼7個(gè)開(kāi)放閱讀框 （ORF1a，ORF1b，ORF2～6）[5]。ORF1a、ORF1b編碼病毒聚合酶，ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白并且可能與PEDV致病性相關(guān)；ORF2、ORF4～6分別編碼病毒纖突糖蛋白（S，150～220 kDa）、次要嵌合蛋白（M，20～30 kDa）、主要嵌膜蛋白（E，7 kDa）以及核衣殼蛋白（N，58 kDa），PEDV整個(gè)基因組的編碼順序?yàn)椋?’UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR[6，7]。

1.2 基因型

由于冠狀病毒RNA酶缺乏校正活性，因此病毒在復(fù)制的過(guò)程中不能保證基因組的保真性，從而導(dǎo)致了病毒遺傳具有多樣性。目前，常以PEDV的S或S1基因（1～735 aa）進(jìn)行血清分型或基因分型。目前已知的PEDV僅有1個(gè)血清型，但是根據(jù)S基因可以將PEDV分為2個(gè)基因型，分別為：1型基因群（G1，主要為經(jīng)典型）以及2型基因群（G2，主要是野毒株或暴發(fā)流行毒株）；每種基因群中均可分為2個(gè)亞型，分別為G1a與G1b亞型，G2a與G2b亞型。G1基因群G1a亞型包括經(jīng)典的毒株，如疫苗毒株CV777等已經(jīng)適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的毒株；G1b亞型包含中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、歐洲近期的變異分離毒株。G2基因群包含全球的野毒株，細(xì)分為G2a與G2b亞型，主要是亞洲當(dāng)前毒株或北美及亞洲大暴發(fā)流行毒株；G2b亞型毒株可能是由G1a毒株亞型毒力位點(diǎn)突變引起的[8]。

與CV777毒株相比較，PEDV G2毒株的S蛋白在N端高變區(qū)存在氨基酸的插入和缺失（55～56氨基酸位點(diǎn)、135～136氨基酸位點(diǎn)分別插入4個(gè)氨基酸以及1個(gè)氨基酸，160～161氨基酸中缺失2個(gè)氨基酸）。除此之外，韓國(guó)、中國(guó)等流行毒株（MF3809與FL2013）為G2毒株S蛋白基因突變產(chǎn)生的新毒株[9]。

G1b毒株是從流行的毒株中分離出來(lái)的，但新型的G1b變異毒株在分子遺傳學(xué)上與G1a毒株、G2毒株顯著不同，G1b毒株不包含G2野毒株S基因發(fā)生變異的典型特征。以S蛋白三分之一N末端基因進(jìn)行基因進(jìn)化樹(shù)分析顯示，G1b毒株與G1a經(jīng)典毒株的同源性為95%，與G2流行毒株的同源性低于89%。對(duì)于PEDV S基因其他部分進(jìn)行分析表明G1b毒株與G2野毒株的同源性超過(guò)99%；PEDV全基因組進(jìn)化分析結(jié)果表明G1b亞型毒株與G2流行野毒株親緣性相近[10]。

2 PEDV編碼蛋白及其生物學(xué)功能

PEDV基因組編碼7個(gè)開(kāi)放閱讀框，ORF1a與ORF1b編碼12個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1～7，9～13），主要參與病毒的復(fù)制過(guò)程；ORF2、ORF4～6分別編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S，M，E，N），主要與病毒的抗原表位有關(guān)或病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白或核衣殼蛋白相關(guān)[7]；ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，是PEDV唯一的輔助因子，可能與病毒的毒力有關(guān)，但其具體功能尚不清楚。

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白

2.1.1 纖突蛋白S（S蛋白）

S蛋白由1 383個(gè)氨基酸組成，屬于Ⅰ型糖蛋白，大小約180～200 kDa，是病毒粒子表面的糖基化纖突蛋白，含有病毒粒子的主要抗原表位。S蛋白包含4個(gè)部分，分別為信號(hào)肽區(qū)（1～18 aa）、4個(gè)中和表位（499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa以及 1 368～1 374 aa）、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 （1 334～1 356 aa）以及1個(gè)短的胞漿區(qū)（1 357～1 383 aa）。S蛋白是PEDV的主要表面抗原，在調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞受體蛋白與病毒的相互作用中起著重要的作用，并能介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，最為重要的是可刺激宿主產(chǎn)生中和抗體。因此，S蛋白可以作為疫苗和抗病毒藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)[11]。

S蛋白主要以三聚體的形式錨定在病毒粒子表面，并且通過(guò)S1（1～789 aa）結(jié)構(gòu)域和S2（790～1383 aa）結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)細(xì)胞黏附及膜融合。當(dāng)宿主細(xì)胞膜受體與病毒粒子S1受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，經(jīng)一系列的細(xì)胞反應(yīng)，激活信號(hào)肽上酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。S1區(qū)域內(nèi)包含著PEDV的主要抗原表位，S1蛋白C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）與宿主細(xì)胞膜上的氨肽酶N（APN）相互作用誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[12]。但也有研究者使用PEDV S1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的N末端區(qū)域（NTD231-501）利用大腸桿菌表達(dá)出PEDV S蛋白的N末端區(qū)，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，口服的蛋白可與小腸上皮細(xì)胞中的M細(xì)胞特異性結(jié)合，可誘導(dǎo)分泌產(chǎn)生高滴度的特異性抗體IgA，表明該區(qū)域可以作為疫苗作用的候選區(qū)域，為疫苗的研發(fā)提供新的思路[13]。通過(guò)對(duì)各種冠狀病毒的S序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，S2序列較S1序列更加保守，S2為膜融合的亞單位，包括HR1和HR2兩部分，研究發(fā)現(xiàn)HR1與HR2相互作用的肽段可以抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞[14]。

2.1.2 糖基化膜蛋白（M蛋白）

M蛋白長(zhǎng)度為681 bp（編碼226個(gè)氨基酸），是病毒粒子包膜最為豐富的蛋白，在病毒裝配以及出芽的過(guò)程中起到重要作用。M蛋白基因較為保守，可以將其作為分子生物學(xué)診斷的靶基因。M蛋白具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，在病毒的外部帶有短的氨基末端結(jié)構(gòu)域，在病毒的內(nèi)部含有較長(zhǎng)的羧基末端結(jié)構(gòu)域[15]。糖基化膜蛋白可用于 PED 血清學(xué)診斷[16，17]。

2.1.3 核衣殼蛋白（N蛋白）

N蛋白長(zhǎng)度為1 326 bp（編碼442個(gè)氨基酸），分子量約55～58 kDa，存在6～7個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，主要組成PEDV的衣殼蛋白。N蛋白具有高度的保守性，分為3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：C端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域，其與基因組RNA形成RNP復(fù)合體并且參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[18]。N蛋白是全基因組中的相關(guān)磷酸化蛋白，其抗原決定簇是誘導(dǎo)機(jī)體免疫的重要組成成分，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)[19]；N蛋白免疫機(jī)體后可引起系統(tǒng)免疫和黏膜免疫，可作為免疫增強(qiáng)劑或分子佐劑[20]。

N蛋白可以通過(guò)封閉NF-κB通路，抑制IFN-β及IFN-λ的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。PEDV N蛋白通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S期從而抑制腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，刺激上皮細(xì)胞高水平表達(dá)IL-8，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[22]。

2.1.4 小糖膜蛋白（E蛋白）

E蛋白長(zhǎng)度為231 bp，編碼76個(gè)氨基酸，是PEDV病毒粒子中最小的結(jié)構(gòu)蛋白，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。E蛋白能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NF-κB的激活，能上調(diào)IL-8和Bcl-2的表達(dá)[23]，主要在病毒的復(fù)制和出芽過(guò)程中起重要作用。

2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白

ORF3是由224個(gè)氨基酸組成的非結(jié)構(gòu)蛋白，是PEDV中唯一的輔助性蛋白，重量約25 kDa。ORF3能夠編碼一種具鉀離子活性的通道蛋白，同時(shí)通過(guò)影響病毒向細(xì)胞外的釋放而調(diào)節(jié)病毒的繁殖[24]。ORF3與PEDV細(xì)胞適應(yīng)性及病毒毒力相關(guān)，改變ORF3基因可以提高PEDV在體外細(xì)胞內(nèi)的適應(yīng)性并且減弱病毒的毒力，ORF3可以作為PEDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)并且毒力減弱的標(biāo)志[25]。研究人員利用反向遺傳手段構(gòu)建出含有不同毒株ORF3的感染性克隆，結(jié)果顯示含有完整的ORF3蛋白抑制病毒在細(xì)胞中復(fù)制，而將ORF3基因截短或者對(duì)ORF3基因進(jìn)行點(diǎn)突變可以緩解這種效應(yīng)；研究還發(fā)現(xiàn)ORF3基因中L81區(qū)域在構(gòu)建感染性克隆中拯救PEDV中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)該區(qū)域在病毒感染宿主起關(guān)鍵性作用[26]。

PEDV復(fù)制酶編碼序列占病毒全基因組的2/3，由ORF1a和ORF1b 2個(gè)開(kāi)放閱讀框組成，2個(gè)開(kāi)放閱讀框之間有46 nt的重疊區(qū)域，重疊區(qū)域中存在1個(gè)滑動(dòng)序列和1個(gè)假節(jié)結(jié)構(gòu)。該假節(jié)結(jié)構(gòu)能引起滑動(dòng)序列發(fā)生-1位核糖體移碼翻譯，最終形成2個(gè)多聚蛋白（PP1a和PP1ab）。PP1a和 PP1ab被內(nèi)部蛋白酶水解成Nsp1α、Nsp1β和Nsp2～12，最終加工成為16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1～Nsp16）。PP1ab在病毒感染早期發(fā)揮重要作用，主要是對(duì)負(fù)鏈RNA、前導(dǎo)RNA、亞基因組RNA和子代病毒RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并切割多聚蛋白產(chǎn)生功能性蛋白[3，27-29]。

3 PEDV感染宿主機(jī)制

冠狀病毒有廣泛的宿主（主要為哺乳動(dòng)物），如人類(lèi)、蝙蝠、鯨魚(yú)以及鳥(niǎo)類(lèi)等，但是每一種病毒限定在特定的宿主范圍或者是只感染自然宿主。此外，冠狀病毒對(duì)呼吸道以及腸道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞有明顯的趨向性。

3.1 PEDV感染細(xì)胞機(jī)制

PEDV的感染具有組織受限性，病毒只在天然宿主的小腸絨毛上皮細(xì)胞或腸細(xì)胞中復(fù)制增殖。豬小腸上皮細(xì)胞表面表達(dá)的PEDV細(xì)胞受體——豬氨肽酶N（pAPN）。PEDV S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域是識(shí)別pAPN受體的表位，兩者通過(guò)直接膜融合將病毒轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞，病毒脫殼后將核酸釋放至細(xì)胞質(zhì)中[12，30，31]。PEDV除了在天然宿主的原代靶細(xì)胞中可以進(jìn)行培養(yǎng)外，還可以使用Vero和 MARC-145細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)[32，33]。在使用Vero細(xì)胞系分離PEDV時(shí)，使用胰酶預(yù)處理，將S蛋白分割成S1與S2 2個(gè)亞基，促進(jìn)PEDV與細(xì)胞相結(jié)合，確保將病毒的核酸釋放至細(xì)胞內(nèi)，從而保證病毒的復(fù)制以及體外繁殖擴(kuò)增。然而，一些細(xì)胞減毒PEDV毒株（SM98-1毒株和83P-5毒株）可以在不使用胰蛋白酶預(yù)處理的情況下在細(xì)胞系中繁殖[30，34-36]。

由于病毒只能在細(xì)胞中擴(kuò)增繁殖，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或者信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以便病毒本身適應(yīng)在宿主細(xì)胞中的自身繁殖。蛋白組學(xué)分析顯示PEDV感染Vero細(xì)胞參與的細(xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)均受到影響。PEDV通過(guò)不依賴(lài)半胱天冬酶的線粒體凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）途徑在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PEDV通過(guò)激活3種主要的促絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)感染細(xì)胞，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）以及c-Jun N末端激酶（JNK）[37，38]。此外，PEDV還可以誘導(dǎo)ER應(yīng)激并激活NF-κB途徑。PEDV感染宿主細(xì)胞并參與復(fù)制的過(guò)程依賴(lài)于多細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程，體外感染PEDV細(xì)胞外的刺激會(huì)出現(xiàn)如細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)以及ER應(yīng)激等信號(hào)通路[22，23]。

3.2 PEDV致病機(jī)制

絕大多數(shù)研究認(rèn)為PEDV經(jīng)消化道系統(tǒng)感染宿主，并主要集中在小腸絨毛上皮細(xì)胞中進(jìn)行增殖，感染后的豬腸道上皮細(xì)胞死亡致使絨毛縮短、絨毛上皮細(xì)胞消化吸收功能下降，最終引起豬只出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、厭食等臨床癥狀，持續(xù)時(shí)間大約1個(gè)星期。病毒感染小腸絨毛頂端和兩側(cè)的上皮細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，腸道上皮絨毛變短、腸道萎縮，導(dǎo)致腹瀉。由于仔豬腸道的細(xì)胞較成年豬只腸道細(xì)胞更新較慢，因此PEDV感染后，仔豬腸道細(xì)胞（更新約1周左右）出現(xiàn)大量死亡后呈現(xiàn)透明癥狀，致使仔豬無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等現(xiàn)象而死亡；成年豬只腸道細(xì)胞（更新為1～2 d）更新較快，在壞死的腸道上皮細(xì)胞脫落后，會(huì)有細(xì)胞補(bǔ)充，出現(xiàn)一過(guò)性的嘔吐、腹瀉、厭食等癥狀一過(guò)性的感染，病死率較低。感染PEDV的仔豬可以通過(guò)RT-PCR和IHC技術(shù)在肺臟、肝臟、腎臟以及脾臟中檢測(cè)到[39]。

近期研究表明，PEDV也可以通過(guò)呼吸道感染宿主，空氣中的PEDV病毒進(jìn)入鼻腔，在鼻上皮細(xì)胞中積累并傳播。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）作為抗原遞呈細(xì)胞，可能在病毒進(jìn)入鼻粘膜并轉(zhuǎn)移至CD3+T細(xì)胞中起作用。攜帶病毒的T細(xì)胞通過(guò)淋巴細(xì)胞再循環(huán)進(jìn)入血液并到達(dá)腸道，引起典型的豬流行性腹瀉癥狀[40]。

4 展望

在過(guò)去的20～30年里，PEDV已經(jīng)給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了一定的困擾。2013年北美發(fā)現(xiàn)PEDV后，蔓延至整個(gè)美洲大陸，此后多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有PED病例的相關(guān)報(bào)道。盡管研究學(xué)者已經(jīng)在病原學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)以及疫苗免疫學(xué)取得一定成就，但是大部分研究是在PEDV傳播至北美后開(kāi)始的。

PEDV暴發(fā)以來(lái)，危害程度愈演愈烈，其主要原因是沒(méi)有有效的疫苗與藥物。目前，PEDV的致病機(jī)理尚未明朗，嚴(yán)重阻礙了有效藥物的研發(fā)，臨床上絕大部分使用經(jīng)典毒株CV777疫苗免疫豬群，但效果一般；部分生產(chǎn)工作者使用自家組織滅活苗或者返飼等方法進(jìn)行本場(chǎng)豬群的免疫接種，采集母豬乳汁檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生較高滴度的IgA，可有效保護(hù)仔豬免于感染PEDV。因此，PEDV免疫接種的關(guān)鍵在于毒株，免疫接種時(shí)了解當(dāng)?shù)氐牧餍卸局辏x擇適當(dāng)?shù)囊呙缰赀M(jìn)行免疫接種。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，PEDV有以下幾個(gè)方面研究亟待加強(qiáng)：①加強(qiáng)PEDV流行病學(xué)調(diào)查，分離新毒株并進(jìn)行基因組學(xué)與蛋白組學(xué)研究；②加強(qiáng)PEDV病毒分離方法及技術(shù)研究，部分專(zhuān)家提出PEDV的基因組可能與病毒的分離密切相關(guān)，因此可將基因組學(xué)應(yīng)用至PEDV分離方法研究中；③加強(qiáng)PEDV感染細(xì)胞機(jī)制的研究，深入研究病毒融合細(xì)胞機(jī)制，探討結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞融合中發(fā)揮的具體作用；④加強(qiáng)PEDV感染宿主后介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答機(jī)制的相關(guān)研究，探討PEDV在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的免疫相關(guān)研究，闡明宿主抗病毒機(jī)制以及PEDV免疫逃逸機(jī)制；⑤加強(qiáng)新型疫苗研究，利用新型載體尤其是黏膜免疫相關(guān)載體進(jìn)行研究，充分發(fā)揮黏膜免疫相關(guān)功能；⑥加強(qiáng)PEDV相關(guān)結(jié)構(gòu)域的功能，如S1 N端或C端結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)產(chǎn)生的的免疫反應(yīng)等。