霍辰思，劉 偉，樊新萍，白牡丹，尚勇進

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，山西太原030031；2.園藝植物脫毒與繁育技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，山西太谷030815）

草莓屬薔薇科多年生雌雄同株草本植物，自花結(jié)實率低，生產(chǎn)上一般采用人工授粉或蜜蜂授粉方式提高其坐果率和授粉率[1]?；ǚ圪|(zhì)量的好壞主要是通過花粉活力進行評判，在果樹授粉前都會對其父本花粉進行生活力測定[2]。近幾年，隨著溫室大棚蓬勃發(fā)展，草莓種植業(yè)也快速提升。目前，我國種植的草莓品種基本上都是從美國以及日、韓等國家引進的外來品種，草莓親本遺傳背景狹窄，培育本土優(yōu)良性狀草莓品種顯得尤為重要。迄今為止，常規(guī)雜交育種仍是我國品種選育的主要途徑[3]，掌握草莓不同品種花粉特性，是合理配置授粉植株、提高草莓坐果率的重要依據(jù)。

目前，對花粉活力的鑒定方法可歸納為染色劑法、電鏡形態(tài)觀察法、萌芽測定法、田間授粉法等[4]。其中，染色劑法根據(jù)染色液類別不同，又可分為I2-KI染色法、TTC染色法、MTT染色法、亞歷山大染色法、醋酸洋紅染色法和苯胺藍染色等；萌芽測定法包括離體萌發(fā)測定法和活體萌發(fā)測定法[5]。染色法雖然操作簡單，但由于染色液大部分為有毒試劑，且測定結(jié)果差異較大，僅適用于田間授粉快速檢測；而與染色法相比，花粉離體萌發(fā)試驗雖然操作復(fù)雜，但用該方法測定所得數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，是目前雜交育種中花粉生活力測定的常用方法[6]。

本研究采用花粉離體萌發(fā)法測定草莓花粉的生活力（通過設(shè)計蔗糖濃度梯度為0、5%、10%、15%；硼酸濃度梯度為0、0.10%、0.15%，瓊脂濃度為4 g/L），對4個品種草莓花粉進行培養(yǎng)，旨在篩選出適合草莓花粉萌發(fā)的最優(yōu)培養(yǎng)基，并進一步探討不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對花粉活力的影響，為今后草莓雜交授粉及新品種選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

選取香野、章姬、圣誕紅和紅顏4個草莓品種花粉為供試材料，其采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所草莓大棚。于2020年4月23日至6月4日10：00左右采集大、中花蕾于紙袋中，晾置于溫度25℃陰涼通風(fēng)室內(nèi)；后用鑷子將健康花藥剝?nèi)肓蛩峒堈鄢傻男『?，放入干燥器中；待花藥自然開裂散粉后，將其收入小瓶中，置于4℃冰箱中貯藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 草莓花粉數(shù)量及畸形花粉率統(tǒng)計 收集草莓中花蕾期花朵，剝?nèi)⊥暾】祷ㄋ?0～20枚，放入干燥的玻璃小瓶中，于干燥器中散粉，待花粉完全散出后，加入1 mL蒸餾水充分振蕩；用移液管吸取0.1 mL花粉水，用蒸餾水稀釋至10 mL，然后用移液槍吸取4μL花粉水滴于含凹槽載玻片上，在電子顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，統(tǒng)計花粉粒總數(shù)及畸形花粉粒數(shù)，重復(fù)3次。采用花粉管離體萌發(fā)法測定花粉萌發(fā)率。

1.2.2 草莓花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基的篩選 通過設(shè)計蔗糖和硼酸不同濃度配比，配置硼酸濃度為0、0.10%、0.15%；蔗糖濃度為0、10%、15%；瓊脂濃度為4 g/L的固體培養(yǎng)基，每組濃度梯度重復(fù)6次。使用前可用微波爐將培養(yǎng)基加熱融化后，吸取100μL培養(yǎng)基于凹面載玻片上，待凝固后用解剖針挑取少量花粉均勻散播在培養(yǎng)基上；將載玻片放入鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到帶蓋的手術(shù)盤中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)5 h以上，在電子顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.2.3 草莓花粉萌發(fā)最佳時間的篩選 為進一步研究培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)的影響，試驗設(shè)置0、2、4、6、8、10 h時間梯度，用解剖針挑取適量花粉均勻散播在花粉萌發(fā)培養(yǎng)基（0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂）上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，每次處理重復(fù)3次，在電子顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)狀況，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.2.4 草莓花粉萌發(fā)最佳溫度的篩選 試驗從低溫到高溫設(shè)置6個溫度梯度，分別為5、10、15、25、35、45℃。將花粉均勻撒播在0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，每次處理重復(fù)3次；培養(yǎng)6～8 h后放到顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，并統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003對試驗數(shù)據(jù)進行處理，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，繪制圖表；采用SPSS軟件進行單因素方差分析、Duncan多重比較，檢驗草莓不同品種花粉萌發(fā)率的差異（在α＝0.05/0.01水平上進行比較），6次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉數(shù)量及畸形花粉率分析

從表1可以看出，香野、章姬、圣誕紅和紅顏每枚花藥中的花粉數(shù)量分別為20 267、26 467、25 133、10 933粒；正?；ǚ蹟?shù)分別為17 100、20 200、17 600、7 000粒；4個品種的畸形花粉率除章姬和圣誕紅差異不顯著，香野和紅顏差異極顯著，畸形花粉率從高到低依次為紅顏＞圣誕紅＞章姬＞香野，香野畸形花粉最少，畸形花粉率為15.74%，紅顏畸形花粉數(shù)最多，畸形花粉率為36.27%。

表1 不同草莓品種畸形花粉率分析

2.2 花粉最適培養(yǎng)基的篩選

從表2可以看出，4個品種花粉萌發(fā)率隨蔗糖和硼酸濃度的增加呈先升后降的趨勢；當(dāng)培養(yǎng)基的蔗糖濃度為15%和硼酸濃度為0.10%時，花粉萌發(fā)率達到最高；其中，香野的花粉在此培養(yǎng)基萌發(fā)率最高，為87.55%，顯著高于紅顏花粉萌發(fā)率（72.38%）；圣誕紅、章姬花粉萌發(fā)率分別為83.05%、83.50%，二者差異不顯著；當(dāng)培養(yǎng)基蔗糖濃度為15%不變、硼酸濃度上升為0.15%時，花粉萌發(fā)率有所下降，圣誕紅、章姬、香野和紅顏萌發(fā)率分別為74.87%、68.04%、77.82%和62.66%，其大小表現(xiàn)為香野＞圣誕紅＞章姬＞紅顏。因此，0.10%硼酸＋15%蔗糖＋ 4 g/L瓊脂為草莓花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基類型的花粉萌發(fā)率分析 %

2.3 花粉萌發(fā)最佳時間的篩選

從表3可以看出，不同培養(yǎng)時間對草莓萌發(fā)率有一定的影響，在4～8 h時，隨時間上升4個草莓品種萌發(fā)率逐漸升高，在8 h萌發(fā)率達到最高；香野萌發(fā)率最高，在8 h花粉萌發(fā)率為88.54%；紅顏花粉萌發(fā)率最低，8 h花粉萌發(fā)率僅為52.14%，極顯著低于其他3個品種。當(dāng)培養(yǎng)時間超過8 h時，4個品種的花粉萌發(fā)率均開始下降，而紅顏的花粉萌發(fā)率繼續(xù)增加，說明并不一定是培養(yǎng)時間越長花粉萌發(fā)率越高。因此，草莓花粉在0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 h為花粉萌發(fā)的最佳時間。

表3 不同培養(yǎng)時間的花粉萌發(fā)率分析 %

2.4 花粉萌發(fā)最佳溫度的篩選

由表4可知，不同培養(yǎng)溫度對草莓萌發(fā)率有很大的影響，隨培養(yǎng)溫度升高4個草莓品種花粉萌發(fā)率呈先升高后下降的拋物線趨勢，在25℃培養(yǎng)8 h萌發(fā)率最高；其中，香野花粉萌發(fā)率最高，為87.50%，高于其他培養(yǎng)溫度；圣誕紅和章姬花粉萌發(fā)率分別為81.24%和82.49%，二者差異不顯著；紅顏萌發(fā)率最低，為66.53%。當(dāng)溫度升高到45℃時，香野仍有少量花粉萌發(fā)，但萌發(fā)率僅為1.01%，其余3個品種幾乎未萌發(fā)，紅顏萌發(fā)率為0。因此，低溫和高溫均不利于草莓花粉萌發(fā)，25℃為4個品種花粉萌發(fā)的最適溫度。

表4 不同培養(yǎng)溫度的花粉萌發(fā)率分析 %

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，花粉活力大小很大程度上受到花粉萌發(fā)率高低的制約，花粉萌發(fā)率越高，花粉活力越好，授粉后果實的坐果率、果實品質(zhì)及雜交授粉成功率越高。草莓畸形果及雜交率低很大程度是由于花粉活力太差。不同植物花粉萌發(fā)所需培養(yǎng)條件各不相同，不僅受自身發(fā)育狀況的影響，也受培養(yǎng)基成分、溫度、培養(yǎng)時間等的影響[7]，當(dāng)培養(yǎng)基蔗糖和硼酸濃度適宜時，花粉萌發(fā)率達到最高且利于花粉管伸長。蔗糖是花粉萌發(fā)和花粉管生長的營養(yǎng)來源，同時又為花粉代謝和跨膜運輸提供能量[8]。但過高的蔗糖濃度又會導(dǎo)致花粉萌發(fā)率降低甚至不萌發(fā)。曾祥久[9]對銀杏花粉培養(yǎng)基優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，蔗糖質(zhì)量濃度為50～100 g/L時，花粉萌發(fā)率最高；當(dāng)質(zhì)量濃度達到150～200 g/L時萌發(fā)率不升反降；宋艷榮[10]對蘋果花粉離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度控制在5%～15%范圍內(nèi)，有利于4種蘋果花粉的萌發(fā)；當(dāng)蔗糖濃度大于10%時，則不利于其花粉萌發(fā)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度維持在10%～15%時最適草莓花粉萌發(fā)；當(dāng)濃度超過15%時，萌發(fā)率降低。此外，花粉離體培養(yǎng)基離不開硼酸的作用，硼不僅是植物生長所需元素，也是花粉萌發(fā)不可或缺的元素，培養(yǎng)基如果缺少硼會導(dǎo)致花粉萌發(fā)過緩、花粉管生長緩慢甚至抑制其生長[11]。在花粉萌發(fā)過程中，硼酸能促進花粉對能源物質(zhì)的吸收和利用，所以適宜濃度的硼酸也有利于花粉的萌發(fā)[12]。在本試驗中，硼酸濃度為0.10%時，4個草莓花粉萌發(fā)率達到最大值，其他濃度下其萌發(fā)率差異不顯著；當(dāng)硼酸濃度超過0.15%時，花粉萌發(fā)率降低。也有研究表明，一定濃度的CaCl2對花粉萌發(fā)具有促進作用[13]。張瑞等[14]在對薄殼山核桃花粉研究時發(fā)現(xiàn)，Ca2+是花粉管極性生長不可缺少的物質(zhì)，而花粉管尖端是Ca2+集中分布區(qū)域，外源給予一定濃度的鈣源能促進花粉管伸長。在今后的試驗中也可嘗試在培養(yǎng)基中加入適量的CaCl2，以達到花粉萌發(fā)的最佳效果。

此外，花粉活力也會受到溫度的影響，溫度與花粉活力呈負(fù)相關(guān)[15]。杜紀(jì)紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，一般花粉貯藏溫度越低壽命越長，當(dāng)外界溫度升高時花粉內(nèi)部呼吸強度變大，使其代謝旺盛、水分流失、營養(yǎng)物質(zhì)耗損、酶活性減弱、產(chǎn)生有害次生代謝產(chǎn)物，這些都會加快花粉的衰老與死亡。龐夫花等[17]對草莓新品種寧玉的花粉特性研究發(fā)現(xiàn)，寧玉花粉在溫度達到45℃時仍有萌發(fā)，而紅顏在45℃時已不萌發(fā)。本研究中，只有香野草莓在45℃下有少量花粉萌發(fā)，萌發(fā)率僅為1.01%，其他3個品種幾乎未萌發(fā)；當(dāng)溫度處于25℃時，4個品種草莓均達到最高萌發(fā)率，與王壯偉等[18]對豐香草莓花粉的研究結(jié)果一致。

不同品種花粉萌發(fā)時間也略有不同，草莓相對于桃、杏、李等薔薇科果樹花粉萌發(fā)慢，薛曉敏等[19]對李花粉萌發(fā)時間篩選發(fā)現(xiàn)，李花粉萌發(fā)快，2 h下花粉萌發(fā)即可滿足授粉需求；王壯偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，草莓花粉萌發(fā)高峰為3 h，3～5 h花粉萌發(fā)率趨于穩(wěn)定；龐夫花等[17]將寧玉花粉培養(yǎng)8 h后花粉萌發(fā)率達到最高，隨著培養(yǎng)時間延長花粉萌發(fā)率逐漸下降。本試驗中，4個品種花粉萌發(fā)率隨著培養(yǎng)時間的延長呈先升后降的拋物線曲線，最強萌發(fā)時間為8 h。

本研究采用準(zhǔn)確率較高的離體萌發(fā)法測定草莓花粉生活力，結(jié)果表明，4個草莓品種花粉萌發(fā)率最適的培養(yǎng)基為0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂，當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為15%、硼酸濃度為0.10%～0.15%時花粉萌發(fā)率差異不顯著；花粉萌發(fā)最佳溫度為25℃，花粉萌發(fā)時間為8 h最適宜觀察統(tǒng)計。香野具有較強的花粉活力，花粉數(shù)量多、畸形花粉率低，這與實際生產(chǎn)上香野草莓果實個大、果實光澤強、果品質(zhì)量高、畸形果率低等生理現(xiàn)象相符。香野草莓是一個比較容易栽培、經(jīng)濟效益高的優(yōu)良品種，在育種上可以考慮將其作為父本材料進行授粉，以提高雜交后代的品質(zhì)和抗性。紅顏較其他3個品種花粉萌發(fā)率低，畸形花粉數(shù)也較多，這與龐夫花等[16]測定紅顏花粉萌發(fā)率的研究結(jié)果相似。盡管生產(chǎn)上紅顏草莓已成為國內(nèi)草莓種植業(yè)栽培面積最大的品種，但是由于其抗病性較差，以其作為親本篩選抗病后代的概率較低。