·論著·

Tn相關區(qū)域在不同種屬臨床分離菌中多態(tài)性及跨種屬轉(zhuǎn)移可能的機制

聶璐，吳奎海，陳平熹，楊漢才，李煒煊

528000 廣東，佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科（聶璐、吳奎海、李煒煊）；527200 廣東，羅定市人民醫(yī)院檢驗科（陳平熹、楊漢才）

復合轉(zhuǎn)座子 Tn一直被認為介導了基因的轉(zhuǎn)移，本研究通過分析基因在不同種屬的基因環(huán)境，提出基因轉(zhuǎn)移的可能機制。

以 GenBank 庫不同種屬細菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的含有 Tn及 Tn-like 轉(zhuǎn)座子為研究對象，通過生物信息學技術比較分析基因環(huán)境的差異，結(jié)合基因環(huán)境中各種插入元件的工作機制，推測基因跨種屬轉(zhuǎn)移的可能機制。

一共有 11 條含有 Tn或者 Tn-like 的全質(zhì)粒序列納入分析。這些質(zhì)粒序列來自不同種屬，包括鮑曼不動桿菌、腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌。除鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的質(zhì)粒類型的不相容組別未知外，其他種屬來源的質(zhì)粒不相容組別涉及 IncU、IncFII(Yp)、IncN、IncL/M、IncL/M、IncA/C2和 IncR 嵌合型，IncA/C、IncFIIK和 IncT。上述結(jié)果強烈的提示基因的跨種屬轉(zhuǎn)移不是質(zhì)粒的廣泛播散而更可能是轉(zhuǎn)座子或者更小的可移動元件參與其中的事件。進一步對 Tn、Tn-like 轉(zhuǎn)座子及 Tn相關區(qū)域的分析發(fā)現(xiàn)了基因在轉(zhuǎn)移中側(cè)翼的相對保守區(qū)是 IS--IS結(jié)構。

結(jié)合 IS和 IS元件的工作機制，推測 IS--IS結(jié)構極有可能介導了基因在不同種屬的廣泛播散。

Tn；基因； 氨基糖苷類； 碳青霉烯類； 耐藥機制； 跨種屬轉(zhuǎn)移機制

細菌耐藥性的產(chǎn)生和廣泛播散是當前人類健康面臨的最重大的挑戰(zhàn)之一，是全球公共衛(wèi)生領域中迫切需要采取行動的重要問題。隨著臨床醫(yī)療和畜牧養(yǎng)殖領域大量無節(jié)制地使用甚至濫用廣譜抗生素，細菌在抗生素壓力選擇下也不斷地進化產(chǎn)生新的、功能更為強大的耐藥酶以適應環(huán)境需要。16S rRNA 甲基化酶 ArmA 由基因編碼，它能甲基化 16S rRNA A 位點內(nèi)部的特定位點，使氨基糖苷類抗生素失去與其靶點（核糖體 30S 亞基）結(jié)合的能力，從而喪失后續(xù)抑制細菌蛋白質(zhì)合成的效力。該酶不水解藥物，而是保護細菌自身免受藥物的攻擊。ArmA 介導細菌對所有臨床一線使用的氨基糖苷類抗生素包括阿米卡星、妥布霉素和慶大霉素等耐藥且均為高水平耐藥（最小抑菌濃度 MIC > 1024 μg/ml）[1]。

2003 年，基因首次在肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌中檢出[2-3]。迄今基因已呈現(xiàn)在全球范圍內(nèi)和不同種屬細菌間廣泛播散的態(tài)勢。基因宿主菌幾乎涉及到所有有重要臨床意義的腸桿菌科細菌各個種屬，包括腸桿菌屬（陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌），威登氏菌屬（普羅威登氏菌、雷氏威登氏菌），克雷伯菌屬（產(chǎn)酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌），沙雷氏菌屬，弗氏志賀菌以及非發(fā)酵菌屬如不動桿菌屬和假單胞菌屬等[4-5]。2007 年報道中國六省市分離的亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌中基因陽性率高達 64.6%[6]。2009 年報道中國溫州分離的肺炎克雷伯菌中基因的陽性率為 2%[7]。2014 年日本報道了抽樣調(diào)查全國 7 省市范圍內(nèi)流行的陽性鮑曼不動桿菌為 ST208 和 ST455 型且呈克隆傳播[8]；2017 年報道了基因從銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌的檢出[9-10]。從 NCBI GenBank 中提交的數(shù)據(jù)分析，攜帶基因的菌株分離地域涉及中國、美國、日本、韓國、法國、波蘭、西班牙、阿富汗等地。

耐藥基因的廣泛播散更大程度地取決于耐藥基因的側(cè)翼序列，即所處的基因環(huán)境，而不是耐藥基因自身?；蜃鳛槔^CTX-M-15和NDM-1之后又一種成功的跨越細菌種屬限制、地域限制，常與多種重要耐藥基因相關聯(lián)并且廣泛播散的耐藥基因，其基因環(huán)境值得進一步深入研究。自 2003 年首次闡述基因以來，一直認為世界范圍內(nèi)的廣泛播散與 Tn有關[2, 11]。本研究選取 GenBank 中代表性種屬中的含有 Tn相關區(qū)域的完整質(zhì)粒序列進行分析，以期為基因跨種屬轉(zhuǎn)移機制的研究提供有效線索。

1 材料與方法

1.1 材料

Tn復合轉(zhuǎn)座子長度為 16.6 kb（GenBank accession 號：AF550415），用該序列比對檢索 NCBI GenBank 庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），符合下列特征的質(zhì)粒序列納入本研究：①Tn相關區(qū)域在全測序的質(zhì)粒上；②Tn相關區(qū)域出現(xiàn)在新的種屬。檢索 GenBank 庫時間為2019 年 6 月。

1.2 方法

從 GenBank 下載納入研究序列的所有 Fasta 文件，導入 CLC Genomics workbench 軟件（版本號 8.5），逐條分析和注釋 Tn相關區(qū)域序列兩個 IS之間的基因，序列中含有的整合子序列提交 INTEGRALL 數(shù)據(jù)庫核定基因盒準確命名（http://integrall.bio.ua.pt/?）。Inkscape 軟件（版本號 6.0）繪制基因座位排列圖，以及用陰影描繪序列與序列之間兩兩比較能匹配（核苷酸相似度> 95%）的區(qū)域。下載所有質(zhì)粒序列，提交 PlasmidFinder 在線網(wǎng)站（https://cge.cbs.dtu.dk/ services/PlasmidFinder/）確定質(zhì)粒類型。

2 結(jié)果

2.1 標準 Tn1548 的結(jié)構特點

Tn的線性結(jié)構（圖 1）描述為 IS-In27- IS-IS--IS----IS其結(jié)構特點呈現(xiàn)為一個基于 IS的復合型轉(zhuǎn)座子（Composite Transposon；cTn），其中有五個 IS 序列，兩個拷貝 IS、IS、IS和 IS。

2.2 Tn1548-like 轉(zhuǎn)座子的結(jié)構特征

根據(jù) NCBI GeneBank 中提供的攜帶基因的質(zhì)粒測序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn) Tn出現(xiàn)了諸多變異形式，如 Tn-like 復合型轉(zhuǎn)座子和 Tn相關區(qū)域（如果兩個 IS有一個缺失，即不能稱為轉(zhuǎn)座子），且其定位的質(zhì)粒大小差異較大（50 ~ 250 kb)，質(zhì)粒的不相容組別多樣，本文 11 條納入分析的質(zhì)粒中，除質(zhì)粒 pCTX-M3 攜帶的是 Tn參考序列外，其余 10 條均是 Tn-like 轉(zhuǎn)座子或者 Tn相關區(qū)域。這11 條質(zhì)粒的質(zhì)粒類型為pKOX_R1（IncU）、pEA49-KPC[IncFII(Yp)]、pMU050（IncN）、pCTX-M3（IncL/M）、pSM_0127（IncL/M）、pNDM1_SZ1（IncA/C2 和 IncR 嵌合）、pSY153-MDR（未知類型）、pMR0211（IncA/C）、pMDR-ZJ06（未知類型）、pKP048（IncFIIK）和pNDM15-1091（IncT），具體如圖 1 所示。

3 討論

3.1 標準 Tn1548 與armA 基因遷徙過程間的關聯(lián)

首次闡述基因（2003 年），是在一株臨床分離肺炎克雷伯菌BM4536 攜帶的IncL/M 型質(zhì)粒 pIP1204 中，質(zhì)粒大小約 90 kb，該質(zhì)粒同時編碼超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-3[2]。基因廣泛轉(zhuǎn)移有兩個基因?qū)W基礎：一是質(zhì)粒，基因被發(fā)現(xiàn)位于不同種屬細菌的不同質(zhì)粒不相容類別的質(zhì)粒上，質(zhì)粒尤其是廣宿主質(zhì)粒，在不同宿主間穿梭介導基因廣泛轉(zhuǎn)移；二是 Tn，定位于 Tn中插入序列共同區(qū)（insertion sequence common region，IS1）下游，兩側(cè)有兩個 IS，這些元件與耐藥基因的廣泛播散密切相關。

Tn的結(jié)構特點呈現(xiàn)為一個基于 IS的復合型轉(zhuǎn)座子，一直被認為是介導基因轉(zhuǎn)移的核心轉(zhuǎn)移元件。其轉(zhuǎn)移的機制理論上是兩個同方向的 IS元件，帶著中間的序列以“剪切、粘貼”的方式進行復制型轉(zhuǎn)座實現(xiàn)耐藥基因分子間的轉(zhuǎn)移。插入序列 IS的轉(zhuǎn)座酶（）是執(zhí)行該轉(zhuǎn)座過程主要的酶。進一步的試驗表明 Tn能夠從構建的質(zhì)粒中成功轉(zhuǎn)移至受體菌的質(zhì)粒中，從而證實了它作為一個整合子是有功能的，可以實現(xiàn) Tn整體的轉(zhuǎn)移[11]。

圖 1 Tn1548、Tn1548-like 轉(zhuǎn)座子和 Tn1548 相關區(qū)域線性結(jié)構比較圖。陰影部分表示序列兩兩之間比較核苷酸相似性大于 95%

Figure 1 Linear comparison of Tn, Tn-like transposon and Tnrelated regions. Shading denotes regions of homology that more than 95% nucleotide identity

Tn有五個 IS 序列，為兩個拷貝 IS、IS、IS和 IS緊鄰基因上游和下游分別有一個 IS和 IS，它們分別屬于 IS和 IS家族成員，其中 IS被發(fā)現(xiàn)與雷氏普羅威登氏菌中的一個轉(zhuǎn)座酶同源性高達76%，推測這兩個 IS 序列首先移動到基因來源菌（目前尚不清楚）的染色體中基因的上下游，介導和啟動了基因在其來源菌的移動[12]。

3.2 Tn1548-like 轉(zhuǎn)座子結(jié)構共性

隨著基因在各種屬的播散，NCBI GeneBank 中提供的攜帶基因的質(zhì)粒測序結(jié)果不斷豐富，我們發(fā)現(xiàn) Tn出現(xiàn)了諸多變異形式，根據(jù)本研究中 11 條質(zhì)粒，這些結(jié)果強烈提示基因的播散不是簡單地廣宿主質(zhì)粒在不同種屬中的直接穿梭，而是更可能涉及轉(zhuǎn)座子進一步參與其中的事件。

比較不同種屬中 Tn、Tn-like 轉(zhuǎn)座子和 Tn相關區(qū)域的結(jié)構共性，我們得出結(jié)論，Tn8 內(nèi)部有一個高度可變區(qū)及相對保守區(qū)，高度可變區(qū)位于 IS元件上游，我們可以看到 IS上游 IS可以缺失，整合子中的 I 型整合酶可以缺失，整合子內(nèi)部的基因盒可以動態(tài)地捕獲或者缺失，I 型整合子的 qacE/sul1 也可以缺失。與此相反的是，IS元件下游至 IS區(qū)域相對保守，IS-IS--IS--- --IS的結(jié)構除了有一株菌中最后一個 IS缺失外（可能由于同源重組丟失），其他菌株中均有這個結(jié)構，只是有些菌株在此結(jié)構基礎上獲得了額外的插入序列，比如在 pMDR-ZJ06中 orf543 內(nèi)部插入了 IS，pKOX_R1 和 pNDM15-1091 中 orf543 上游插入了 IS，假單胞菌中質(zhì)粒 pSY153-MDR 中IS下游和上游分別插入了 IS和 IS。

3.3 armA 基因核心轉(zhuǎn)移元件的推測

有學者曾指出，Tn以及各種 Tn相關元件（插入各種不同的 I 型整合子或者 IS和 IS之間的整合子樣序列）被認為是促進了氨基糖苷類耐藥基因，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因簇(E)-(E)及其他整合子內(nèi)耐藥基因的轉(zhuǎn)移[13]。但是根據(jù)本研究匯總的 Tn、Tn-like 以及 Tn相關區(qū)域在不同種屬的差異和共性，以及 IS元件和 IS元件的特性，我們推測，基因的轉(zhuǎn)移更有可能是 IS和 IS兩個元件共同介導。具體的講，是 IS和 IS元件能形成一個 IS--IS環(huán)形結(jié)構，這個結(jié)構在細菌細胞中的維持依賴于，編碼鮑曼不動桿菌中的復制起始蛋白，能執(zhí)行質(zhì)粒復制起始功能。

綜上所述，基于 Tn，Tn-like 轉(zhuǎn)座子、Tn相關區(qū)域在不同種屬的結(jié)構的差異與共性以及 ISCR1 和 IS26 兩個廣泛參與耐藥基因轉(zhuǎn)移的元件的工作機制，我們推測 IS--IS元件極有可能介導了基因的跨種屬轉(zhuǎn)移，Tn及 Tn-like 轉(zhuǎn)座子作為公認的基因轉(zhuǎn)移的元件，我們不予否認，但是 IS--IS元件可能轉(zhuǎn)移的效率更高，需要進一步設計實驗以證實該推測。

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Polymorphism of Tnassociated regions in different species and possible mechanism ofinterspecies transfer

NIE Lu, WU Kui-hai, CHEN Ping-xi, YANG Han-cai, LI Wei-xuan

000

Composite transposon Tnis thought to mediate the wide spread ofgene. This study aims to analyze the genetic background ofin different species, and propose the possible mechanism of interspecies transfer ofgene.

Using Tnand Tn-like transposons found in different species of bacteria in GenBank as the research object, the difference ofgene environment was compared and analyzed through bioinformatics method, and the possible mechanism ofgene transfer across species was speculated based on the working mechanism of various insertion elements ingene environment.

A total of 11 plasmid sequences contained Tnassociated regions were enrolled in our study. These plasmids were all carried by different species, including.,,. In these species,gene were carried by a wide range of different incompatibility group plasmids, such as IncU, IncFII(Yp), IncN, IncL/M, IncL/M, IncA/C2 and IncR mosaic plasmid, IncA/C, IncFIIKand IncT. These observations strongly suggested transfer ofis not mediated by plasmids, whereas by transposons or smaller transferable element. We analyzed the structures shared the 11 Tnassociated regions, and found that IS--ISregion in Tnwere highly conserved.

Based on the mechanism of ISand IS,we proposed thatIS--ISelementmay mediate thegene transfer across species.

;; Aminoglycosides; Carbapenemes; Resistance mechanisms; Mechanism of interspecies transfer

LI Wei-xuan, Email: lwx21cn@163.com

佛山市衛(wèi)生健康局醫(yī)學科研課題（20200159）

李煒煊，Email：lwx21cn@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.006

Author Affiliations: Department of Laboratory Medicine, The First People′s Hospital of Foshan, Guangdong 528000, China (NIE Lu, WU Kui-hai, LI Wei-xuan); Department of Laboratory Medicine, The People′s Hospital of Luoding, Guangdong 527200, China (CHEN Ping-xi, YANG Han-cai)

2020-06-02