胥 萍，林小靖，付紅偉

(1.浙江大學自貢創(chuàng)新中心，四川 自貢 643000；2.浙江大學華南工業(yè)研究院，廣東 廣州 510000，3.浙江大學，浙江 杭州 310000)

血橙(Citrussinensis)屬蕓香科甜橙類, 因果肉具紅色血絲或血斑而得名。我國引入的血橙品種有路比(Ruby)、塔羅科(Tarocco)、馬耳(Maltaise)、 桑吉耐洛(Sanguinello)、摩洛(Moro)、臍血橙等。其中路比血橙和塔羅科血橙是主要栽培品種，被譽為“血橙之王”，主要分布在四川、廣東、廣西和湖南等地[1]。

血橙具有較高的營養(yǎng)價值，尤其是豐富的維生素C、花青素、抗壞血酸、黃酮類化合物和羥基肉桂酸等營養(yǎng)物質以及K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Ni 等人體必需元素[2]。血橙果肉的紅色是花青素與糖結合形成的苷類化合物所致，是柑橘中唯一含有花青素的品種。花色苷含量是血橙果實的重要質量指標，對人體健康有重要意義，具有抗氧化、抗癌、降低膽固醇、降血壓、增加骨密度、減肥、降血脂和防止心血管疾病等功效[3-5]。花色苷的積累開始于裂片邊緣的囊泡和血橙果實的花端，其濃度與栽培實踐、成熟階段、遺傳、季節(jié)與氣候條件、收獲時間和生理因素密切相關。低溫會增加血橙中花色苷的積累，而高溫會破壞花色苷。采收后的血橙可以在氧化應激條件下刺激花色苷的合成，可提高花色苷的含量[6]。

1 血橙花色苷種類的研究

花色苷是由其配基花青素與糖以糖苷鍵形式結合而成的一類化合物，其苷元(花青素)是基于黃酮離子結構，使花色苷具有強抗氧化劑和清除自由基的作用。同時，黃酮離子的發(fā)色團特性使花青素成為最常見的天然色素。羥基的數(shù)量，糖的性質和數(shù)量，以及這些取代基的位置決定了花色苷個體之間的差異[7]。Mondello等采用高效液相色譜/紫外-可見光分光光度計法(HPLC/UV-Vis)從血橙汁中共分離出27種花色苷峰，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3(6”-丙二酰)-β-葡萄糖苷為主要成分，但并未對其他峰進行定性研究[8]。Lee采用高效液相色譜-二極管陣列法(HPLC-DAD)從巴德血橙中共檢測出了7種花色苷，其中矢車菊素-3(6”-丙二酰)-β-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷含量分別占到了44.8%和33.6%[9]。DUGO等采用微量高效液相色譜-電噴霧-質譜法(Micro-HPLC-ESI/MS)從西西里血橙中共檢測出了8種花色苷，其中芍藥素- 3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香苷、3’ -甲花翠素-3(6”- 丙二酰)葡萄糖苷首次在血橙中被發(fā)現(xiàn)[10]。Winterhalter等采用高速逆流色譜和制備高效液相色譜法從血橙中分離制備花色苷，并采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜(HPLC- ESI-MS/MS)和核磁共振法(NMR)法進行結構分析，除了以上2種主要成分外，還鑒定出了6種其它花色苷，分別為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-槐糖苷、飛燕草素-3(6”-丙二酰)葡萄糖苷、甲基花青素-3(6” -丙二酰)葡萄糖苷、矢車菊素-3-(6” -二乙二酰)葡萄糖苷，其中矢車菊素-3-(6” -二乙二酰)葡萄糖苷是在血橙中首次被發(fā)現(xiàn)[11]。曹少謙等采用高效液相色譜-電噴霧質譜(HPLC- ESI-MS)法首次從血橙花色苷中檢測出了矢車菊素-3-葡萄糖苷的加合物4-乙基鄰苯二酚[12]。

2 血橙花色苷的提取與純化

提取花色苷是從植物中測定總花色苷或者單個花色苷的首要步驟，因此提取方法的選擇對后續(xù)分析花色苷非常重要。在大多數(shù)水果和蔬菜中，花色苷位于表皮細胞附近[13]。提取過程通常涉及使用酸性溶劑，酸性溶劑可以使細胞膜變性，同時溶解花色苷。酸性溶劑可以穩(wěn)定花色苷，但也可能通過破壞花色苷與金屬離子或者其他色素的聯(lián)系來改變組織中花色苷的天然形態(tài)，在濃縮過程中也可能產生?；吞腔乃崴鈁14]。含鹽酸的溶劑在萃取濃縮過程中會導致花色苷降解[14]。為了盡量減少花色苷的分解，使用較弱的有機酸(如甲酸、乙酸、檸檬酸或酒石酸)或少量(0.5%到3%)的揮發(fā)性酸(如三氟乙酸)，在色素濃縮過程中可以去除。在酸存在的情況下進行的程序需要小心操作，以避免酸依賴的花色苷降解[14-15]。同時根據提取方法的不同，降低提取溶劑與植物原料的比例，可以減少濃縮步驟[14]。

用于提取的溶劑體系不是提取花色苷所特有的，在提取過程中還會提取相當多的其他化合物，花色苷的定性和定量分析會因為這些可能干擾測量的化合物如糖類、蛋白質和纖維素等的存在而變得復雜，因此需要純化含花色苷的粗提物，從而提高花色苷的純度來擴大其應用范圍。在純化過程中不同的樹脂被用于純化花色苷，包括離子交換樹脂、聚酰胺樹脂和凝膠等經過純化后濃度可以提高10～20倍[16]。其中凝膠Sephadex LH-20柱層析可用于粗提物純化，也可以用于分離單個花青素。Manley和Shubiak在1975年首次將HPLC應用于單個花色苷分離[17]，HPLC方法目前廣泛的應用于總花色苷和單個花色苷的分離純化中[18]。

曹少謙等[9]將血橙去皮，榨汁離心后取上清液，采用柱色譜法對血橙花色苷制備方法進行了優(yōu)化，探索了12種樹脂對血橙花色苷的吸附和解析能力，最終發(fā)現(xiàn)NKA-9 大孔樹脂的吸附和解析效果最好，且洗脫劑為50%的檸檬酸乙醇溶液(pH值=2.5)。

3 花色苷的穩(wěn)定性及其提高技術

由于花色苷容易發(fā)生反應，很容易降解并形成無色棕色化合物，因此影響花青素穩(wěn)定性的因素很多，包括溫度、pH、氧氣、酶、復合物和金屬離子的存在、抗壞血酸、二氧化硫、糖及其降解產物等[19]。一般而言，降低花色苷溶液的pH值至2.8可以促進結構向黃烷陽離子的轉移，從而增強穩(wěn)定性；改變pH會影響其性質，如果pH低于3，一些多糖不能很好地保護花色苷，從而引起降解。pH高于3，容易引起聚合物如變性蛋白?；ㄉ赵谌芤航橘|中有4種結構的變換，在一定條件下花色苷的4種結構之間存在著平衡：藍色的醌式(脫水)堿(A)、紅色的黃烊鹽正離子(AH+)、無色的假堿(B)和查爾酮(C)。加入其他化合物如酚類化合物，能夠適當延長花青素的穩(wěn)定性；鐵等金屬離子的加入也是一種增加花青素穩(wěn)定性的可行方法。在長期冷藏期間花色苷會發(fā)生變化，花色苷的合成在收獲后繼續(xù)進行，其在血橙中的濃度在冷藏期間增加[2,20]。血橙花色苷 pH4.0時對熱最為敏感。另外，血橙花色苷對熱、光都很不穩(wěn)定。金屬離子都表現(xiàn)出對花色苷熱降解的保護作用，Al3+對血橙花色苷有明顯的增效作用，且隨著濃度增加增色作用越強；Cu2+低濃度下，對花色苷熱降解有一定保護作用，但是高濃度下有明顯的促進花色苷降解的作用。喻最新等[21]發(fā)現(xiàn)經過草酸處理可以明顯提高在儲藏過程中的花色苷含量。

花色苷穩(wěn)定化常用的方法有：添加大分子物質、小分子輔色、金屬離子螯合和微膠囊化等。其中大分子物質常添加的為多糖類(蛋白質、果膠、瓜爾豆膠)、蛋白質(乳蛋白、酵母甘露糖蛋白等)；小分子輔色物質常見的為多酚和黃酮類、肽和氨基酸類、有機酸類；金屬離子螯合劑常見的為Fe3+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Al3+等[22]。微膠囊化是一種用天然或合成高分子材料將固體、液體或氣體等物質包埋形成微小粒子的技術，使被包埋物質與外界環(huán)境隔離，有效保護其原有活性，增加其貯存穩(wěn)定性的過程，在花色苷穩(wěn)定技術中比較常用[22]。微膠囊技術的關鍵點在于微膠囊壁材和制備方法的探究，這決定了微膠囊化包埋的效果以及釋放特性，其中常用的壁材為高分子材料，如殼聚糖、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠、麥芽糊精、蛋白質和卵磷脂等[23-24]。微膠囊的制備方法可分為化學法、物理化學法和物理法，常用的為物理法，包括空氣懸浮包衣法、噴霧干燥法、擠壓法、超分子包合物形成法、空氣蒸發(fā)沉積法、靜電結合法等[25]。其中，噴霧干燥法是乳化液被霧化成微細液滴分散在高溫熱氣流中脫水干燥，微細液滴水分迅速蒸發(fā)，從而實現(xiàn)成膜和干燥，采用該法制成的微膠囊顆粒均一、可溶性好、熱穩(wěn)定性高、適用性廣，且成本低廉、工藝簡單、易于產業(yè)化，在微膠囊產品制備中最常用，據報道有80%～90%的微膠囊都是采用噴霧干燥法制備[26]。目前，已有研究者將黑枸杞、石榴、藍冠果花色苷以及紫蘇油、沙棘果油等通過噴霧干燥法制備微膠囊的報道[27-31]。

4 花色苷的生理活性

花色苷具有多種生理活性，如減少氧化，抗應激和預防冠心病，還能抗菌、消炎和抗癌活動，控制肥胖和糖尿病或改善視力等[32-35]。通過攝入花色苷，以人群為基礎的調查顯示，花色苷與心血管疾病、糖尿病和癌癥發(fā)病率的降低有關[36]。同時研究顯示，不同健康狀況的志愿者攝入富含花色苷的水果后，臨床和生物醫(yī)學指標均有所改善[36]?；ㄉ盏纳飳W效應已經被經典地與它們的抗氧化能力聯(lián)系起來，盡管在生理水平上涉及的實際機制還有待建立[37]。一些體外研究、動物模型和人體試驗的研究表明，植物中的花色苷能夠對組織產生活性氧(ROS)介導的損傷起保護作用[38-39]。Kelebek等[40]采用 DPPH·法評價抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)摩洛血橙抗氧化能力比桑吉耐洛血橙強。Titta等[41]研究發(fā)現(xiàn)血橙花色苷可以抑制大鼠體內的脂肪堆積和體重增加。