戴天明，王敏

1.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院/暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院/廣州市創(chuàng)傷外科研究所，廣東 廣州 510220；2.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院/暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510220

南非醉茄是一種被民間廣泛利用的傳統(tǒng)草藥，它具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。醉茄素A(Withaferin A,WA)是南非醉茄提取物中的主要活性成分[2]。近年來(lái)，有報(bào)道稱WA在膠質(zhì)瘤小鼠模型中具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，而且WA對(duì)肥胖小鼠有強(qiáng)大的抗肥胖和抗糖尿病作用，因此備受關(guān)注[4,5]。雖然南非醉茄提取物的口服保健產(chǎn)品已上市多年，但其主要成分WA的口服生物利用度仍未知，現(xiàn)有報(bào)道僅停留在使用小鼠對(duì)WA進(jìn)行初步藥代動(dòng)力學(xué)研究[3]。為了探索WA的口服生物利用度，本研究利用LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，采用藥物吸收行為與人體更為接近的比格犬，進(jìn)行WA靜脈注射和口服灌胃的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估WA口服給藥的可行性，為藥物臨床前研發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物醉茄素A對(duì)照品(批號(hào)17136605，純度＞99.0%)和澤瀉醇C-23-醋酸酯對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)物，批號(hào)16425087，純度＞99.0%)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。色譜純的甲醇和乙腈購(gòu)自美國(guó)Spectrum公司。其他試劑為市售分析純。超純水由Milli Q超純水系統(tǒng)制備。

比格犬共3只，雄性，體重6.3～7.1kg，健康狀況良好，購(gòu)自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0003)。比格犬在給藥前12h開始禁食，直至給藥后4h恢復(fù)喂食。全程飲水自由。

1.2 儀器分析方法在日本Shiseido Nanospace 1312高效液相色譜系統(tǒng)和美國(guó)AB Sciex 4000 Q Trap?質(zhì)譜儀上建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析方法。數(shù)據(jù)采集與定量軟件為Analyst 1.6。

WA分析的液相條件：采用Venusil MP C18(50×2.1 mm·5μm)色譜柱，流速為0.25mL/min，在室溫下分析WA。流動(dòng)相A為水相(乙腈:水=5:95，V/V)，流動(dòng)相B為有機(jī)相(乙腈:水=95:5，V/V)。水相和有機(jī)相中均含有10mM乙酸銨。液相系統(tǒng)采用梯度洗脫，有機(jī)相的起始比例為30%(V/V)，0.3min時(shí)有機(jī)相開始線性上升，0.5min時(shí)升至100%。之后保持100%至2.4min，然后開始線性下降。2.8分鐘時(shí)有機(jī)相比例回到30%，保持至4min結(jié)束洗脫流程。WA和內(nèi)標(biāo)物在此梯度下保留時(shí)間分別是1.9min和2.2min。

WA分析的質(zhì)譜條件：正離子模式下，離子源溫度550°C，離子噴霧電壓5500V，氣簾氣15psi，霧化氣70psi，輔助氣60psi，碰撞氣中等，入口電壓9V，駐留時(shí)間120ms。WA和內(nèi)標(biāo)物在多反應(yīng)監(jiān)控MRM模式中，定量離子對(duì)分別為471.4～281.2m/z和529.6～451.5m/z，去簇電壓分別為100V和130V，碰撞能量分別為25eV和29eV。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控樣品制備精密稱取WA對(duì)照品兩份，甲醇溶解，兩份對(duì)照品分別制備WA的標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液和質(zhì)控儲(chǔ)備液，濃度為1mg/mL。內(nèi)標(biāo)物澤瀉醇C-23-醋酸酯對(duì)照品用甲醇溶解配制儲(chǔ)備液。WA的工作液濃度范圍為1～10000ng/mL，通過(guò)從儲(chǔ)備液連續(xù)稀釋后獲得。WA的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品，采用空白比格犬血漿和工作液混合制備，標(biāo)準(zhǔn)曲線最終濃度為0.2、0.4、1、5、20、100、500、1600和2000ng/mL。質(zhì)控樣品最終濃度0.4、20和1600ng/mL。所有的儲(chǔ)備液、工作液、含血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品配制后馬上儲(chǔ)存在4°C冰箱中待用。

1.4 血漿樣品處理在100μL血漿樣品中，加入20μL純甲醇和50μL內(nèi)標(biāo)物(1μg/mL)，在冰水浴中渦旋混合。然后加入1.5mL乙酸乙酯，繼續(xù)在冰水浴中振蕩萃取15min。在4°C和14000g離心力下離心5min，取出上層溶液在真空下?lián)]干。使用200μL流動(dòng)相復(fù)溶，注入20μL上清到LC-MS/MS系統(tǒng)中分析。

1.5 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)WA的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分為兩周期給藥，在3只雄性比格犬進(jìn)行。第一周期進(jìn)行WA劑量為1mg/kg靜脈注射給藥實(shí)驗(yàn)，第二周期進(jìn)行WA劑量為2mg/kg口服灌胃給藥實(shí)驗(yàn)，清洗期為7d。WA給藥溶液濃度為1.7mg/mL，使用乙醇-solutol HS 15-純水(10:5:85;V:V:V)的溶劑配制。靜脈給藥實(shí)驗(yàn)采血時(shí)間點(diǎn)為：0、0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h；口服給藥采血時(shí)間點(diǎn)為：0、0.05、0.13、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48h。給藥前和給藥后從比格犬前肢靜脈采集血液約500μL，注入肝素鈉抗凝的離心管中，在4°C、3000g離心力離心5min，收集上層血漿，-80℃冰箱保存待用。

1.6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算檢測(cè)得到的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用DAS(Direct-Attached Storage,DAS)3.0軟件的統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括藥時(shí)曲線下面積AUC(Area Under Curve,AUC)、半衰期t1/2、平均駐留時(shí)間MRT、清除率Cl、表觀分布容積Vd等[6]。

2 結(jié)果

2.1 最低定量限與線性范圍通過(guò)優(yōu)化液相條件，調(diào)整流動(dòng)相成分(乙酸銨和甲酸含量)，以及優(yōu)化藥物萃取條件(乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙醚對(duì)比)，WA的最低定量限為0.2ng/mL，信噪比＞5。通過(guò)線性回歸擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.2～2000ng/mL，回歸方程y=0.0016x+0.005，相關(guān)系數(shù)r2＞0.999，表明此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 WA在比格犬的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)LC-MS/MS分析方法測(cè)得的藥物濃度數(shù)據(jù)，在DAS 3.0軟件進(jìn)行處理，獲得的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：比格犬靜脈注射1mg/kg的WA后，峰濃度為(1392±120)ng/mL，暴露水平AUC0～t為(925±136)ng/(mL·h)，半衰期t1/2為(14.3±2.4)h，平均駐留時(shí)間MRT0-t為(5.8±1.6)h，清除率Cl為(1.1±0.3)L(h·kg)，表觀分布容積Vd為(22.7±4.5)L/kg。比格犬口服灌胃2mg/kg的WA后，達(dá)峰時(shí)間為0.13h，峰濃度為(179±32)ng/mL，暴露水平AUC0～t為(780±197)ng/(mL·h)，半衰期t1/2為(18±4.6)h，平均駐留時(shí)間MRT0～t為(12.6±3.5)h，清除率Cl為(2.6±0.7)L/(h·kg)，表觀分布容積Vd為(67.5±8.9)L/kg。絕對(duì)口服生物利用度計(jì)算公式為F=[(AUC口服/AUC靜注)×(Dose靜注/Dose口服)]×100%，因此，WA在比格犬的口服生物利用度為(42.2±6.4)%。

3 討論

本研究建立的LC-MS/MS方法可成功地應(yīng)用于WA在比格犬的藥代動(dòng)力學(xué)研究。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，此方法靈敏度更高，定量下限比報(bào)道的更低，有利于更準(zhǔn)確分析樣品在體內(nèi)的消除半衰期[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WA在比格犬的口服生物利用度較高，吸收較快(給藥后8min達(dá)到峰值)。與嚙齒類動(dòng)物對(duì)比，利用已報(bào)道的不同實(shí)驗(yàn)室的WA在小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，估算小鼠口服生物利用度約為9%，遠(yuǎn)低于WA在大型動(dòng)物比格犬的生物利用度42%，提示W(wǎng)A在大型動(dòng)物中可能具有更理想的吸收程度[3,7]。此外，WA在比格犬中半衰期較長(zhǎng)，有利于藥物長(zhǎng)時(shí)間在體內(nèi)發(fā)揮藥效。同時(shí)表觀分布容積較大，說(shuō)明藥物可能較多分布在器官組織中。

綜上所述，WA總體上具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，可作為口服候選藥物，進(jìn)行藥物分布、代謝、排泄、安全性等更全面的成藥性評(píng)估和臨床前開發(fā)，為將來(lái)的臨床試驗(yàn)或最終臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。